Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь FAQ Написать работу КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Опыт 7. Обнаружение дегидрогеназ в семенах горохаСодержание книги
Поиск на нашем сайте
Дегидрогеназы – это ферменты, активирующие и отщепляющие водород от окисляемого субстрата. Обнаружение дегидрогеназ основано на их способности передавать водород какому-нибудь акцептору, который, восстанавливаясь, меняет свою окраску. В качестве акцептора водорода может быть взята метиленовая синь, переходящая в восстановленном состоянии в бесцветную лейкоформу. Материал и объекты исследования: проросшие и покоящиеся семена гороха, пробирки, термостат с температурой 30-35°С, спиртовки, спички, держатели для пробирок, 1%-ный раствор метиленовой сини. Ход работы: с семян набухшего гороха снять кожуру. Семена поместить в две пробирки. В одну из них налить воду и довести до кипения, чтобы убить ткани семян. После охлаждения воду слить и обе партии горошин (кипяченые и непрокипяченные) залить 1%-ным раствором метиленовой сини для окрашивания. Через 5–10 мин синь из пробирок слить, семена промыть водопроводной водой. После промывания все семена должны иметь темно-синюю окраску. Окрашенные семена залить отстоянной водопроводной водой, пробирки закрыть резиновыми пробками, то есть создать анаэробные условия, и поместить их в термостат или водяную баню с оптимальной для работы дегидрогеназ температурой (около 30–35°С). Через 1,5–2 ч можно заметить, что непрокипяченные семена теряют синюю окраску. Это происходит потому, что дегидрогеназы, участвующие в дыхании клеток, активировали и сняли водород с дыхательного материала, а затем передали его на метиленовую синь, которая восстановилась и обесцветилась. Если с обесцвеченных семян слить воду, то на воздухе они снова синеют, так как лейкоформа метиленовой сини окисляется. Семена в контрольной пробирке остаются синими, поскольку при кипячении дегидрогеназы разрушились. Аналогичные опыты можно провести с любым неокрашенным растительным материалом. После проведения опыта зарисовать живые и мертвые семена, описать и объяснить полученный результат. Опыт 8. Определение активности лактатдегидрогеназы Лактатдегидрогеназа (L–лактат НАД оксидоредуктаза) относится к числу наиболее активных ферментов, осуществляющих окислительно–восстановительные превращения. Она катализирует реакцию
L–лактат+НАД+↔пируват+НАДН+Н+
При значениях pH, близких к нейтральным, равновесие реакции сдвинуто в сторону образования молочной кислоты и НАД+. Фермент выделен и кристаллическом виде из многих источников и довольно хорошо изучен. Молекулярная масса его около 140 тыс. Лактатдегидрогеназа — тетрамер, состоящий из 2 типов неидентичных субъединиц (H– и М–типа). Разные сочетания субъединиц объясняют существование 5 изоферментов, отличающихся по своим электрофоретическим и другим свойствам и по величине Kм для субстратов. Изоферментный спектр лактатдегидрогеназы в разных тканях различен, соотношение отдельных изоферментов может изменяться при экспериментальных воздействиях и патологии. Лактатдегидрогеназа локализована преимущественно в цитоплазматической фракции, однако в ряде тканей фермент обнаружен и на внешней мембране митохондрий. Доля митохондриального фермента в общей лактатдегидрогеназной активности ткани может достигать, например, в мозгу 5 – 7 %, в большинстве других тканей она не превышает 1 %. Существует несколько методов определения активности лактатдегидрогеназы, основанных как на использовании естественных, так и искусственных акцепторов водорода. Основу данного определения составляет метод Бергмейера и соавт. (1965). Принцип метода. Активность лактатдегидрогеназы оценивается по скорости окисления НАДН (уравнение приведено выше), которая регистрируется спектрофотометрически по убыли величины оптической плотности при длине волны 340 нм. Реактивы: 1) 0,05 MК–фосфатный буфер (pН 7,5), содержащий 3·10–4 моля пирувата (готовят перед экспериментом, растворяя навеску пирувата натрия в К–фосфатном буфере); 2) 9·10–3 M раствор НАДН (готовят непосредственно перед проведением спектрофотометрического анализа). Оборудование: пробирки, кюветы, спектрофотометр, гомогенизатор, центрифуга с охлаждением. Ход работы Навеску ткани печени или мозга массой 200 мг гомогенизируют при температуре 4 ºС с 1,8 мл охлажденной средой выделения:0,25 Мраствор сахарозы, содержащий1 мМЭДТА рН 7,4 (разведение 1:9, т.е 10 % гомогенат). Полученный гомогенат центрифугируют 15 минут при14000 g, в супернатанте определяют активность фермента. В кювету спектрофотометра (1 см) наливают инкубационную среду, состоящую из 3,0 мл К–фосфатного буфера, содержащего пируват, и 0,05 мл раствора НАДН. Затем вводят 0,1 мл образца, содержащего фермент (гомогенат ткани, цитоплазматическая фракция или суспензия митохондрий), быстро перемешивают и измеряют исходную величину оптической плотности (Е1). Регистрацию показаний спектрофотометра проводят с интервалом 30 св течение 3–5 минут рассчитывают среднее значение изменения оптической плотности пробы за 1 мин (ΔЕ). Лактатдегидрогеназа — очень активный фермент, поэтому предварительно необходимо подобрать соответствующее разведение анализируемых образцов (30 – 50 раз). Например, цитоплазматическую полученную из 10 %–го гомогената печени крыс после осаждения ядер и митохондрий, следует разнести (бидистиллированной водой – или К–фосфатнымбуфером) в 30–50 раз. Оптимальное разведение препарата такое, при котором ΔЕ /мин при длине полны 340 нм составляет 0,040 – 0,080. Расчет Активность лактатдегидрогеназы (в мкмолях НАДН/мин наа 1 мг белка) вычисляют по формуле: X=ΔEV/6,22a (мкмоль НАДН/мин на 1 мг белка), где Δ E — среднее значение изменений оптической плотности пробы при длине волны 340 нм за 1 мин; V – конечный объем пробы в кювете (3,15 мл); 6,22 — коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов при длине волны 340 нм; А – содержание белка в пробе, определенное в параллельном образце методом Лоури или другим, мг. Описанный метод определения активности лактатдегидрогеназы высокоспецифичен, прост, дает хорошо воспроизводимые результаты и может быть использован при анализе активности фермента в различных тканевых препаратах и биологических жидкостях. Оформление работы Составить блок–схему эксперимента. Привести расчеты по приготовлению реактивов. Определить активность в предложенных пробах, привести расчеты. Расчет соотношения НАД/НАДН Соотношение НАД/НАДН в цитозоле рассчитывают на основе константы равновесия энзиматической реакции катализируемой лактатдегидрогенозой равной K = 1,11·10–4 и концентраций ее субстратов: пирувата и лактата, применяя уравнение [пируват]/[лактат] = K[НАД]/[НАДН] (Williamson и сотруд.,1967). Опыт 9. Определение активности каталазы Каталаза – фермент, катализирующий реакцию расщепления пероксида водорода с образованием кислорода и воды. За ходом реакции можно следить по объему выделившегося кислорода. Реактивы и материалы: растительный материал (листья или корни хрена, свежепророщенные семена или клубень картофеля); мел; 3 %-ный раствор пероксида водорода. Оборудовани е: установка для сбора газа (рисунке 3); ступка с пестиком; стакан.
Рисунок 3- Газометрический прибор для определения активности каталазы. 1 – реакционная колба; 2 – зажим; 3 – бюретка с делениями; 4 – сосудик для раствора пероксида водорода; 5 – делительная воронка. Стеклянные части прибора соединены резиновой трубкой. Ход работы 1. Растительный материал (0,5 г) разотрите в ступке с 20 см3 дистиллированной воды с добавлением небольшого количества мела (для создания слабощелочной среды). Оптимальное значение рН для каталазы составляет 7,7. 2. Гомогенат ткани оставьте на 5 – 10 мин. для отстаивания и затем полученный раствор перенесите в реакционную колбу (1). 1. В небольшой сосудик (4) влейте 5 см3 3 %-го раствора пероксида водорода и осторожно пинцетом поставьте его внутрь реакционной колбы (1). 2. При открытом зажиме (2) осторожно плотно закройте реакционную колбу (1) пробкой газометрического прибора. 3. Закройте зажимом (2) сообщение с атмосферой и одновременно переверните сосудик (4) с перекисью внутри реакционной колбы (1). Пероксид смешивается с гомогенатом, содержащим каталазу, что вызовет разложение пероксида и выделение кислорода. 4. Выделяющийся кислород, попадая сверху в бюретку (3), будет отжимать воду вниз. По понижению уровня воды в бюретке судят об объеме выделившегося кислорода. Для того чтобы выровнять давление выделяющегося кислорода с атмосферным давлением, необходимо выровнять уровни воды в бюретке и воронке (5), опуская воронку (5) вниз. 5. Определите объем выделившегося кислорода через разные промежутки времени от начала реакции (1, 2, 3, 4, 5 мин.). 6. Активность каталазы выражается в миллилитрах О2, выделенного за время опыта, в расчете на 1 г сырой растительной ткани. Оформление результатов Результаты проведенного исследования оформите в виде таблицы.
|
||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2016-12-16; просмотров: 1064; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.116.63.107 (0.012 с.) |