Опыт 7. Обнаружение дегидрогеназ в семенах гороха

Дегидрогеназы – это ферменты, активирующие и отщепляющие водород от окисляемого субстрата. Обнаружение дегидрогеназ основано на их способности передавать водород какому-нибудь акцептору, который, восстанавливаясь, меняет свою окраску. В качестве акцептора водорода может быть взята метиленовая синь, переходящая в восстановленном состоянии в бесцветную лейкоформу.

Материал и объекты исследования: проросшие и покоящиеся семена гороха, пробирки, термостат с температурой 30-35°С, спиртовки, спички, держатели для пробирок, 1%-ный раствор метиленовой сини.

Ход работы: с семян набухшего гороха снять кожуру. Семена поместить в две пробирки. В одну из них налить воду и довести до кипения, чтобы убить ткани семян. После охлаждения воду слить и обе партии горошин (кипяченые и непрокипяченные) залить 1%-ным раствором метиленовой сини для окрашивания. Через 5–10 мин синь из пробирок слить, семена промыть водопроводной водой. После промывания все семена должны иметь темно-синюю окраску.

Окрашенные семена залить отстоянной водопроводной водой, пробирки закрыть резиновыми пробками, то есть создать анаэробные условия, и поместить их в термостат или водяную баню с оптимальной для работы дегидрогеназ температурой (около 30–35°С).

Через 1,5–2 ч можно заметить, что непрокипяченные семена теряют синюю окраску. Это происходит потому, что дегидрогеназы, участвующие в дыхании клеток, активировали и сняли водород с дыхательного материала, а затем передали его на метиленовую синь, которая восстановилась и обесцветилась. Если с обесцвеченных семян слить воду, то на воздухе они снова синеют, так как лейкоформа метиленовой сини окисляется.

Семена в контрольной пробирке остаются синими, поскольку при кипячении дегидрогеназы разрушились. Аналогичные опыты можно провести с любым неокрашенным растительным материалом. После проведения опыта зарисовать живые и мертвые семена, описать и объяснить полученный результат.

Опыт 8. Определение активности лактатдегидрогеназы

Лактатдегидрогеназа (L–лактат НАД оксидоредуктаза) относится к числу наиболее активных ферментов, осуществляющих окислительно–восстановительные превращения. Она катализирует реакцию

 

L–лактат+НАД⁺↔пируват+НАДН+Н⁺

 

При значениях pH, близких к нейтральным, равновесие реакции сдвинуто в сторону образования молочной кислоты и НАД⁺. Фермент выделен и кристаллическом виде из многих источников и довольно хорошо изучен. Молекулярная масса его около 140 тыс. Лактатдегидрогеназа — тетрамер, состоящий из 2 типов неидентичных субъединиц (H– и М–типа). Разные сочетания субъединиц объясняют существование 5 изоферментов, отличающихся по своим электрофоретическим и другим свойствам и по величине Kм для субстратов. Изоферментный спектр лактатдегидрогеназы в разных тканях различен, соотношение отдельных изоферментов может изменяться при экспериментальных воздействиях и патологии. Лактатдегидрогеназа локализована преимущественно в цитоплазматической фракции, однако в ряде тканей фермент обнаружен и на внешней мембране митохондрий. Доля митохондриального фермента в общей лактатдегидрогеназной активности ткани может достигать, например, в мозгу 5 – 7 %, в большинстве других тканей она не превышает 1 %.

Существует несколько методов определения активности лактатдегидрогеназы, основанных как на использовании естественных, так и искусственных акцепторов водорода. Основу данного определения составляет метод Бергмейера и соавт. (1965).

Принцип метода. Активность лактатдегидрогеназы оценивается по скорости окисления НАДН (уравнение приведено выше), которая регистрируется спектрофотометрически по убыли величины оптической плотности при длине волны 340 нм.

Реактивы:

1) 0,05 MК–фосфатный буфер (pН 7,5), содержащий 3·10^–4 моля пирувата (готовят перед экспериментом, растворяя навеску пирувата натрия в К–фосфатном буфере);

2) 9·10^–3 M раствор НАДН (готовят непосредственно перед проведением спектрофотометрического анализа).

Оборудование: пробирки, кюветы, спектрофотометр, гомогенизатор, центрифуга с охлаждением.

Ход работы

Навеску ткани печени или мозга массой 200 мг гомогенизируют при температуре 4 ºС с 1,8 мл охлажденной средой выделения:0,25 Мраствор сахарозы, содержащий1 мМЭДТА рН 7,4 (разведение 1:9, т.е 10 % гомогенат). Полученный гомогенат центрифугируют 15 минут при14000 g, в супернатанте определяют активность фермента.

В кювету спектрофотометра (1 см) наливают инкубационную среду, состоящую из 3,0 мл К–фосфатного буфера, содержащего пируват, и 0,05 мл раствора НАДН. Затем вводят 0,1 мл образца, содержащего фермент (гомогенат ткани, цитоплазматическая фракция или суспензия митохондрий), быстро перемешивают и измеряют исходную величину оптической плотности (Е₁). Регистрацию показаний спектрофотометра проводят с интервалом 30 св течение 3–5 минут рассчитывают среднее значение изменения оптической плотности пробы за 1 мин (ΔЕ).

Лактатдегидрогеназа — очень активный фермент, поэтому предварительно необходимо подобрать соответствующее разведение анализируемых образцов (30 – 50 раз). Например, цитоплазматическую полученную из 10 %–го гомогената печени крыс после осаждения ядер и митохондрий, следует разнести (бидистиллированной водой – или К–фосфатнымбуфером) в 30–50 раз. Оптимальное разведение препарата такое, при котором ΔЕ /мин при длине полны 340 нм составляет 0,040 – 0,080.

Расчет

Активность лактатдегидрогеназы (в мкмолях НАДН/мин наа 1 мг белка) вычисляют по формуле:

X=ΔEV/6,22a (мкмоль НАДН/мин на 1 мг белка),

где Δ E — среднее значение изменений оптической плотности пробы при длине волны 340 нм за 1 мин;

V – конечный объем пробы в кювете (3,15 мл);

6,22 — коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов при длине волны 340 нм;

А – содержание белка в пробе, определенное в параллельном образце методом Лоури или другим, мг.

Описанный метод определения активности лактатдегидрогеназы высокоспецифичен, прост, дает хорошо воспроизводимые результаты и может быть использован при анализе активности фермента в различных тканевых препаратах и биологических жидкостях.

Оформление работы

Составить блок–схему эксперимента. Привести расчеты по приготовлению реактивов. Определить активность в предложенных пробах, привести расчеты.

Расчет соотношения НАД/НАДН

Соотношение НАД/НАДН в цитозоле рассчитывают на основе константы равновесия энзиматической реакции катализируемой лактатдегидрогенозой равной K = 1,11·10^–4 и концентраций ее субстратов: пирувата и лактата, применяя уравнение

[пируват]/[лактат] = K[НАД]/[НАДН] (Williamson и сотруд.,1967).

Опыт 9. Определение активности каталазы

Каталаза – фермент, катализирующий реакцию расщепления пероксида водорода с образованием кислорода и воды. За ходом реакции можно следить по объему выделившегося кислорода.

Реактивы и материалы: растительный материал (листья или корни хрена, свежепророщенные семена или клубень картофеля); мел; 3 %-ный раствор пероксида водорода.

Оборудовани е: установка для сбора газа (рисунке 3); ступка с пестиком; стакан.

 

Рисунок 3- Газометрический прибор для определения активности каталазы. 1 – реакционная колба; 2 – зажим; 3 – бюретка с делениями; 4 – сосудик для раствора пероксида водорода; 5 – делительная воронка. Стеклянные части прибора соединены резиновой трубкой.

Ход работы

1. Растительный материал (0,5 г) разотрите в ступке с 20 см³ дистиллированной воды с добавлением небольшого количества мела (для создания слабощелочной среды). Оптимальное значение рН для каталазы составляет 7,7.

2. Гомогенат ткани оставьте на 5 – 10 мин. для отстаивания и затем полученный раствор перенесите в реакционную колбу (1).

1. В небольшой сосудик (4) влейте 5 см³ 3 %-го раствора пероксида водорода и осторожно пинцетом поставьте его внутрь реакционной колбы (1).

2. При открытом зажиме (2) осторожно плотно закройте реакционную колбу (1) пробкой газометрического прибора.

3. Закройте зажимом (2) сообщение с атмосферой и одновременно переверните сосудик (4) с перекисью внутри реакционной колбы (1). Пероксид смешивается с гомогенатом, содержащим каталазу, что вызовет разложение пероксида и выделение кислорода.

4. Выделяющийся кислород, попадая сверху в бюретку (3), будет отжимать воду вниз. По понижению уровня воды в бюретке судят об объеме выделившегося кислорода. Для того чтобы выровнять давление выделяющегося кислорода с атмосферным давлением, необходимо выровнять уровни воды в бюретке и воронке (5), опуская воронку (5) вниз.

5. Определите объем выделившегося кислорода через разные промежутки времени от начала реакции (1, 2, 3, 4, 5 мин.).

6. Активность каталазы выражается в миллилитрах О₂, выделенного за время опыта, в расчете на 1 г сырой растительной ткани.

Оформление результатов

Результаты проведенного исследования оформите в виде таблицы.

Время, мин	Объем кислорода, мл	Масса навески растительного сырья, г	Активность каталазы, мл О2, на г сырого вещества за время опыта