Количественное определение ДНК

Реактивы: 5% – й раствор хлорида натрия, дифениламиновый реактив (1г дифениламина в 100 мл ледяной уксусной кислоты,

+ 2,75мл H₂SO₄ конц.), печень, дистиллированная вода.
Оборудование: гомогенизатор, центрифуга, центрифужные весы, центрифужные пробирки, стакан химический на 100 мл, пипетка на 10 мл, цилиндры на 25 и 50 мл, стеклянные палочки, штатив с пробирками, водяная баня

Ход работы

Навеску ткани печени 500 – 100 мг гомогенизируют в 5—10 мл 5% – го раствора хлорида натрия. Полученный гомогенат переносят в центрифужные пробирки, уравновешивают их на цент­рифужных весах и центрифугируют 10 – 15 минут при 1500 – 3000 об/мин

Надосадочную жидкость делят на 2 части. В одной из пробирок проводят качественную реакцию на ДНК (см. ниже). Вторую пробирку помещают в кипящую водяную баню, предварительно добавив 3 мл 2 % – го раствора серной кислоты для проведения гидролиза (гидролиз проводят в течении часа). Гидролизат охлаждают, центрифугируют. В надосадочной жидкости содержатся составные компоненты нуклеопротеидов

 

 

Метод основан на свойстве дезоксирибозы, входящей в состав ДНК, образовывать синее окрашивание прямо пропорциональное концентрации ДНК.

Реактивы: дифениламиновый реактив (1 г дифениламина в 100 мл ледяной уксусной кислоты, + 2,75 мл H₂SO₄конц.), дистиллированная вода, водный раствор ДНК.

Оборудование: термостат, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.

Ход работы

Вначале необходимо построить калибровочный график. Для этого в 3 пробирки наливают по 1мл раствора ДНК с различной концентрацией (50, 100, 200 мкг/мл) и по 2 мл дифениламинового реактива. Помещают пробирки на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню для развития окраски, затем определяют оптическую плотность каждого из растворов при длине волны 595 нм. Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрацию использованных растворов ДНК, по оси ординат – соответствующие им значения оптической плотности.

Затем берут две пробирки: в контрольную пробирку наливают 1 мл воды, в опытную пробирку – 1 мл водного раствора ДНК (неизвестной концентрации). В каждую пробирку добавляют по 2 мл дифениламинового реактива. Обе пробирки помещают на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню. Затем пробы охлаждают и измеряют насыщенность окраски против контроля при λ = 595 нм. Зная оптическую плотность пробы, по калибровочному графику находят количество ДНК в ней.

Состав проб

 

Про– бирки	ДНК (мл)	Дифенил– аминовый реактив (мл)	H2O (мл)
50 (мкг/мл)	100 (мкг/мл)	200 (мкг/мл)	Х (мкг/мл)
		–	–	–		–
	–		–	–		–
	–	–		–		–
Х	–	–	–			–
К	–	–	–	–
10 – 15 мин кипящ. водян. баня
охладить, измерить оптич. плотность при λ=595 нм

 

 

Практическое задание

1) Запишите формулы нуклеотидов ГТФ, УДФ, дАМФ, дТДФ, дЦТФ.

a) в составе нуклеотидов обведите карандашом пуриновые азотистые основания;

б) подчеркните нуклеотиды, содержащие рибозу, одной чертой, а нуклеотиды, содержащие дезоксирибозу – двумя чертами.

2) Напишите формулу тринуклеотида А–Ц–Г.

a) укажите фосфодиэфирные связи;

б) отметьте 5’– и 3’–концы.

3) Дан фрагмент одной из цепей ДНК:

Г–Ц–Т–А–А–Т–Ц–Г–Ц–Т–А–Г.

a) Запишите нуклеотидную последовательность второй комплементарной цепи;

б) укажите 5’– и 3’–концы в цепях ДНК.

4) Фрагмент иРНК имеет следующую нуклеотидную последовательность:

^5’А–Ц–У–А–Ц–Ц–А–Ц–А–А–Ц–Г–У–Г–А^3’

a) определите, сколько аминокислот закодировано в данном фрагменте;

б) пользуясь таблицей генетического кода, определите закодированную аминокислотную последовательность;

в) по фрагменту иРНК установите первичную структуру обеих цепей ДНК, отметьте транскрибируемую цепь, укажите 5’– и 3’–концы в цепях ДНК.

5) Пептид имеет следующую структуру:

фен–ала–арг–гли–тре–сер

a) может ли несколько иРНК, отличающихся друг от друга первичной структурой, кодировать данный пептид или нет?

б) запишите две различные последовательности иРНК, кодирующие данный пептид, укажите 5’– и 3’–концы в иРНК.

 

Лабораторная работа №11

ЭКСТРАКЦИЯ фосфопротеинфосфатазы

(ФПФазы)