Влияние температуры на активность фермента

a-амилазы слюны (термолабильность ферментов)

Активность ферментов зависит от температуры. Та температура, при которой активность фермента наибольшая, называется температурным оптимумом (opt-t°). Для организма человека opt-t° находится в пределах 37-40°С. Снижение t° приводит к уменьшению активности ферментов, и при очень низких температурах (О° - +4°С) ферментативная активность практически прекращается, т.к. резко изменяются кинетические свойства ферментов. Поэтому снижение активности ферментов имеет обратимый характер: при повышении температуры ферментативная активность полностью восстанавливается.

Повышение t выше opt-t° приводит к постепенному снижению активности и при достижении определенной t для каждого фермента – к полной инактивации фермента, которая является необратимой. При t - 60°С, (для некоторых 70-100°С) происходит денатурация белка-фермента, разрушение активного центра фермента, образование Е-S-комплекса становится невозможным, и ферментативная реакция прекращается.

(На термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация S, рН среды и др. факторы.)

 

Ход работы

В 4 пробирки отмерить по 4 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл слюны, разведенной в 10 раз. Пробирку 1 поместить в кипящую баню, 2 пробирку в ледяную баню, пробирку 3 –в термостат при температуре 38°С, пробирку 4 оставить при комнатной температуре.Через 10 минут содержимое каждой пробирки разделить на 2 части и провести пробу Фелинга, а с другой частью –пробу Люголя.

Реакция Люголя. Реакция обнаруживает крахмал. К содержимому пробирки добавить 1 каплю раствора Люголя. Появление синего окрашивания свидетельствует о наличии крахмала.

Реакция Фелинга. К содержимому пробирки добавить примерно половину объема реактива Фелинга. Верхний слой жидкости нагреть на пламени спиртовки. Появление желтого окрашивания, переходящего в кирпично-красное, указывает на наличие редуцирующих углеводов.

 

Результат оформляют в виде таблицы, объясняют причины разной активности a-амилазы в зависимости от температуры.

 

Nпроб	Температура °С	Реакция с реактивом Люголя	Проба Фелинга	выводы

 

Влияние рН на активность амилазы

Оптимум - рН для различных ферментов имеет различное значение, это зависит от аминокислотного состава ферментов,

оpt рН для a-амилазы слюны – 6,8-7,0;

- липазы панкреатической – 7,0-8,5;

- пепсина 1,5 - 2,5;

- аргиназы – 9,5- 10,0;

- сахаразы кишечной- 5,8-6,2.

Любое изменение реакции среды (в кислую или щелочную сторону от оптимума – рН) снижает активность фермента. Последнее связано с изменением диссоциации ионогенных групп ферментного белка (в том числе и в активном центре). В результате меняется конформация всей молекулы фермента и форма активного центра. Таким образом, комплементарность между субстратом и активным центром фермента нарушается, образование фермент-субстратного комплекса замедляется и активность фермента снижается.

Изменение диссоциации ионогенных групп может происходить и в некоторых субстратах, что также приводит к нарушению комплементарности между активным центром и субстратом.

Смещение же рН в сильно кислую или щелочную сторону может вызывать денатурацию ферментного белка, потерю нативной конформации и разрушение активного центра фермента. Последнее исключает возможность образования фермент-субстратного комплекса и приводит к инактивации фермента.

Ход работы

1.В три пробирки вносят по 3 мл буферных растворов с рН 1,2; 6,8; 10.

2.Во все пробирки прибавляют по 2 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл разбавленной в 10 раз слюны. Содержимое пробирок перемешивают и помещают в термостат при 40°С на 10 минут.

3.Пробирки охлаждают, и с содержимым проделывают реакции Люголя и реакцию Фелинга. При этом следует учесть, что реакция на крахмал с раствором Люголя положительна только в кислой или нейтральной среде, а проба Фелинга протекает в щелочной среде.

4.Наблюдают результаты и данные вносят в таблицу.

 

 

Nпроб	Рh среды	Реакция с реактивом Люголя	Проба Фелинга	Выводы

 

Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

Целью работы является установление усиливающего или ингибирующего влияния различных ионов на каталитическую активность ферментов. Так, например, ионы натрия и хлора стимулируют активность амилазы слюны, а ионы меди, наоборот, тормозят ее.

Ход работы. В з пробирки налить по 1 мл разведенной в 10 раз слюны. В первую пробирку добавить 1 мл 1% раствора NaСI, во вторую – 1мл 1% CuSO₄, в третью- 1 мл дистиллированной воды (контроль). После этого в каждую пробирку прилить по 4 мл 0,5% раствора крахмала, пробирки встряхнуть и поместить в водяную баню или термостат с температурой 38°С на 10 минут. По истечении указанного времени с содержимым каждой пробирки проделать реакцию на крахмал и пробу Фелинга. Полученные данные занести в таблицу.

N	Субстрат	Фермент	Активатор или ингибитор	Проба на крахмал	Проба фелинга	Выводы

 

 

Домашнее задание

Решить тестовые задания:

Выберите правильный ответ.

Ферменты – это

1- сложные белки;

2- производные витаминов;

3- белки, являющиеся обязательными структурными компонентами клеток

4- биокатализаторы белковой природы.

Выберите правильный ответ.

Под воздействием ферментов скорость ферментативной химической реакции:

1- уменьшается

2- увеличивается

3- не изменяется

3. Выберите правильные ответы.

Ферменты

1 – увеличивают скорость химических реакций

2 - термолабильны

3 – в процессе реакции не расходуются

4 – чувствительны к небольшим изменениям рН

5 – увеличивают энергию активации

6 – обладают высокой специфичностью

4. Выберите правильные ответы.

Небиологические катализаторы:

1 – увеличивают скорость химических реакций

2 - термолабильны

3 – в процессе реакции не расходуются

4 – чувствительны к небольшим изменениям рН

5 – увеличивают энергию активации

6 – обладают высокой специфичностью

Выберите правильный ответ.

Витамин В₁ входит в состав кофактора:

1. НАД⁺

2. ФАД

3. ТПФ

Выберите правильный ответ.

Витамин В₂ входит в состав кофактора:

1-НАД⁺

2-ФАД

3-ТПФ

Выберите правильный ответ.

Витамин РР входит в состав кофактора:

1-НАД⁺

2-ФАД

3-ТПФ

Выберите правильный ответ.

К пиридинзависимым дегидрогеназам относят:

1 – производные витамина В₂

2 – производные витамина РР

Выберите правильный ответ.

Коферменты, содержащие витамин В₂

1- никотинамидные

2-пиридоксалевые

3-флавиновые

4-кофермент А

10. Выберите правильные ответы.

Апофермент имеет следующие характеристики:

1- это комплекс белка и кофактора

2- обладает высокой каталитической активностью

3- представляет собой производное витамина

4- не обладает ферментативной активностью

5- определяет специфичность фермента

Выберите правильный ответ.

Изоферменты –это:

1- олигомерные биокатализаторы, гетерогенные по структуре, но изогенные по действию;

2- вещества белковой природы, не обладающие свойствами фермента;

3- ферменты, работающие по принципу конвейера;

1- холоферменты, состоящие из апофермента и кофактора.

Выберите правильный ответ.

Ферменты ускоряют химическую реакцию, так как:

1- в процессе реакции разрушаются;

2- ускоряют тепловое движение молекул субстрата;

3- снижают величину энергии активации реакции.

13. Выберите правильные ответы.

Основные свойства активного центра:

1 - термолабилен

2 – это небелковая часть холофермента

3 – гидрофобен

4 – термостабилен

5 – стабилизирует апофермент

14. Выберите правильные ответы.

Причиной снижения активности фермента при увеличении температуры (выше 40°):

1- изменение нативной конформации;

2- разрушение третичной структуры;

3- разрушение активного центра;

4- невозможность образования фермент-субстратного комплекса, а следовательно, и продукта реакции;

5- нарушение комплементарности между активным центром и субстратом.

15. Выберите правильные ответы.

Причиной снижения активности фермента при снижении температуры

(от 40° С до 0°) является:

1- денатурация ферментного белка;

2- разрыв слабых связей (водородных, гидрофобных)

3- временное замедление активности вследствие снижения кинетических свойств молекул субстрата и фермента;

4- замедление образования фермент-субстратного комплекса;

5- изменению конформации фермента.

Выберите правильный ответ.

Цитоплазматические ферменты имеют оптимум рН при:

1- рН< 7

2- рН> 7

3- рН= 7

Выберите правильный ответ.

Температура, при которой фермент денатурирует:

1- 0°С

2- 80-100°С

3- 10-20°С

4- 30-40°С

18. Выберите правильные ответы.

Причиной изменения ферментативной активности при увеличении температуры от 50 до 100 °С является:

1- нарушение комплементарности между активным центром фермента и субстратом;

2- изменение скорости движения молекул субстрата;

3- разрушение нативной конформации ферментного белка;

4- гидролиз пептидных связей в молекуле фермента.

Выберите правильный ответ.

Специфичность сложного фермента определяется строением

1- апофермента

2- кофермента

20. Выберите правильные ответы.

Активный центр фермента имеет следующие характерные особенности:

1- это участок, непосредственно взаимодействующий с субстратом и

участвующий в катализе

2- между активным центром и субстратом имеется комплементарность

3- активный центр составляет относительно небольшую часть молекулы фермента

4- в активный центр входят только полярные аминокислоты

21. Выберите правильные ответы.

Основные функции и свойства активного центра

1 – обеспечивает образование фермент-субстратного комплекса

2 - гидрофобное образование в молекуле фермента

3 – относительно небольшой участок молекулы фермента

4 – небелковая часть холофермента

Выберите правильный ответ.

Участок молекулы фермента, ответственный за присоединение субстрата и осуществление ферментативного катализа называется:

1- гидрофобный центр

2- каталитический центр

3- активный центр

4- адсорбционный центр

5- аллостерический центр

23. Выберите правильные ответы.

Для осуществления ферментативной реакции необходимы:

1- определенная ориентация субстрата в области активного центра фермента

2- взаимное изменение конформации субстрата и фермента

3- наличие аллостерического центра

4- комплементарность формы активного центра фермента и субстрата

Выберите правильный ответ.

Активность аллостерических ферментов регулируется путем присоединения модуляторов к:

1- активному центру

2- кофактору

3 - регуляторному центру

5- каталитическому центру

6- субстратному центру

Выберите правильный ответ.

Активация аллостерических ферментов происходит путем:

1- фосфорилирование фермента

2- взаимодействия пространственно удаленных участков фермента

3- разрыва связей между протомерами

4- кооперативного взаимодействия протомеров

Выберите правильный ответ.

Причиной конформационных изменений, приводящих к изменению активности аллостерических ферментов является:

1- фосфорилирование фермента

2- гидролиз пептидных связей

3- разрыв связей между субъединицами

4- изменение кооперативного взаимодействия субъединиц

27. Выберите правильные ответы.

При активации ферментов методом ограниченного протеолиза происходит:

1- отщепление коротких пептидов от профермента

2- присоединение пептида в стороне от активного центра фермента

3- изменение конформации фермента и образование активного центра

4- отщепление кофермента от фермента

28. Выберите правильные ответы.

Конкурентное ингибирование происходит, если:

1 – субстрат и ингибитор похожи по структуре

2- субстрат и ингибитор не похожи по структуре

3- ингибитор связывается в активном центре фермента

4- ингибитор связывается не с активным центром фермента, а с другим участком поверхности фермента

29. Выберите правильные ответы.

Обратимое ингибирование фермента возникает, если:

1- фермент и ингибитор связаны ионной связью

2- фермент и ингибитор связаны водородной связью

3- фермент и ингибитор связаны гидрофобными взаимодействиями

4- фермент и ингибитор связаны ковалентно

Выберите правильный ответ.

Необратимое ингибирование фермента возникает, если:

1- фермент и ингибитор связаны ковалентно

2- фермент и ингибитор связаны водородной связью

3- фермент и ингибитор связаны гидрофобными взаимодействиями

4- фермент и ингибитор связаны ионной связью

Выберите правильный ответ.

Все ферменты делятся на классы на основе:

1- типа катализируемой химической реакции

2- химической природы фермента

3- химической природы субстрата

Выберите правильный ответ.

В основе деления ферментов на классы лежит:

1- строение субстрата

2- строение продуктов реакции

3- тип катализируемой реакции

4- строение кофермента

33. Выберите правильные ответы.

Ферменты, используемые в целях энзимодиагностики должны:

1- обладать органоспецифичностью

2- поступать в кровь при повреждении органов

3- иметь низкую активность или полностью отсутствовать в сыворотке крови в норме

4-иметь высокую стабильность

34. Выберите правильные ответы.

Основные направления использования в медицине протеолитических ферментов (пепсина, трипсина)

1- для очистки ран и участков омертвевшей ткани

2- в лечении злокачественных образований

3- при недостаточном синтезе этих ферментов в организме или секреции

4- для диагностики заболеваний желудочно-кишечного тракта

5- нарушении переваривания белков в желудке

Выберите правильный ответ.

При остром панкреатите в крови обнаруживаются ферменты:

1- лактатдегидрогеназа

2- a-амилаза

3- креатинфосфокиназа

Выберите правильный ответ.

У пациента с острыми болями в области сердца обнаруживается преимущественное повышение активности аминотрансфераз в крови

1- АлАТ

2- АсАТ

 

37.Выберите правильные ответы

Снижение содержания белков плазмы крови (гипопротеинемия) приводит:

1- к увеличению осмотического давления в капиллярах

2- к появлению отеков

3- к снижению онкотического давления

4- к увеличению транспорта жирных кислот альбуминами плазмы

38.Выберите правильные ответы

Гипопротеинемия за счет снижения количества альбуминов наблюдается при:

1- усилении биосинтеза белков крови

2- поражении печеночных клеток

3- белковом голодании

4- сильных ожогах

5- заболеваниях почек

6- избыточном потреблении белков с пищей

 

СПИСОК ОСНОВНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Лекции по биохимии

2. Северин Е.С. Биохимия. М. 2003

3. Северин Е. С. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. М. 2001

4. Березов Т.Т., Коровкин В.Ф. Биологическая химия, 1982.

5. Строев В.А. Биологическая химия, 1986.

6. Николаев А.Я. Биологическая химия,1989.

7. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача.1984.

 

СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Страйер Л. Биохимия М. Мир. 1984

2. Уайт А., Хенглер Ф. Смит Э. и др. Основы биохимии, М. 1981

3. Марри Р. Греннер Д. Биохимия человека, 1993

4. Коровкин Б.Ф. Ферменты в жизни человека. Л. Медицина, 1972

 

Занятие 5