Работа № 2. Количественное определение активности каталазы

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 1

(для студентов)

 

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Введение в биохимию, современные методы исследования.

2. Учебная цель занятия: Ознакомиться с предметом биохимии, методами и техникой лабораторных работ.

3. Задачи занятия:

1. Получить представление о предмете биохимии: целях, задачах, областях применения, основных достижениях; о структуре предмета и практических занятиях, правилах техники безопасности и культуре поведения в лабораториях кафедры.

2. Изучить методику получения биологического материала: плазмы, сыворотки крови, гомогената и экстрактов тканей, органелл клеток, клеток тканей.

3. Научиться работать на центрифуге.

4. Провести исследование содержания аминокислот в плазме крови, методом хроматографии.

5. Научиться работать на фотоэлектроколориметре.

6. Ознакомиться с принципом действия биохимического анализатора, его возможностями и спектром применения.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Получение плазмы крови методом центрифугирования.

2. Тонкослойная хроматография аминокислот плазмы крови.

3. Фотоэлектроколориметр: принцип метода, техника работы на приборе.

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Получение плазмы крови методом центрифугирования.

Принцип метода: Принцип центрифугирования основан на том, что клетки крови осаждаются в центробежном поле. Скорость сендиментации (осаждения) зависит от плотности раствора, молекулярной массы, формы, размеров осаждаемых частиц (органелл или клеток и др.).

Ход работы: Цитратная кровь, приготовленная лаборантами, наливается в центрифужную пробирку 1,0 мл, а в противовес ей готовят центрифужную пробирку с 1,0 мл воды. Обе пробирки устанавливают в противоположные гнезда ротора центрифуги. Закрывают крышку центрифужной камеры и включают центрифугу на 5 минут, плавно разгоняя ротор до 3000 об/мин. По окончании центрифугирования, при полной остановке ротора, открывают крышку и достают пробирки. Полученная плазма крови или образующаяся при центрифугировании гомогенатов тканей надосадочная жидкость используется для хроматографии аминокислот в работе № 2.

Работа № 2. Тонкослойная хроматография плазмы крови.

Принцип метода: Тонкослойная хроматография основана на различии в степени адсорбции разделяемых веществ микропористым адсорбентом (окись алюминия и др.) и их растворимости в растворителе.

Ход работы:

1. а) Каплю плазмы капилляром нанести на линию старта хроматографической полоски и сушить на воздухе 2-3 минуты. б) Каплю смеси эталонных образцов (фен и глу) капилляром нанести на линию старта другой полоски, и просушить 2-3 минуты.
2. Обе полоски поместить в хроматографические камеры (большие пробирки), погружая их на 2-3 мл в растворитель (вода:бутанол:ацетат) на 60 минут для хроматографического разделения.
3. По окончании разгонки отмечают фронт распространения растворителя и сушат в термостате 3-5 минут.
4. Хроматографические полоски проявляют нингидрином, дающим с аминокислотами цветную реакцию и вновь сушат в термостате до появления ярко выраженных цветных пятен. Наличие аминокислот может быть идентифицировано с помощью коэффициента распределения (Rf): Rf = a/b, где a – расстояние пройденное аминокислотой от линии старта, b – расстояние пройденное растворителем от линии старта.

Данный метод должен проводиться с соблюдением всех условий, указанных в справочнике: температура, время разгонки, растворитель. По этому наиболее простым и применимым является метод эталонных образцов (метод «свидетелей»), который заключается в том, что исследуемая смесь аминокислот и известные аминокислоты («свидетели») наносятся на линию старта одновременно и разгоняются в одинаковых условиях.

Работа № 3. Фотоэлектроколориметрия.

Принцип метода: фотометрия основана на измерении поглощения света определенной длины волны проходящего через исследуемый раствор. Окрашенные растворы образуются после проведения цветных реакций, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации определяемых веществ. Цифровые величины, регистрируемые фотоэлектроколориметром на шкале оптической плотности прибора (нижняя шкала), отражают экстинцию (Е) – оптическую плотность.

Ход работы:

1. Знакомство с прибором и прилагаемой к нему инструкцией.
2. Определение экстинции опытного (Еоп) и стандартного (Ест) растворов и перевод

экстинции в концентрации (Соп и Сст) с помощью калибровочного графика, построенного по нескольким стандартным концентрациям изучаемых веществ. Если график окажется прямолинейным, то для простоты можно произвести расчет опытной концентрации (Соп) исходя из значения одной стандартной концентрации (Сст) по формуле: СОП = ССТ • ЕОП/ЕСТ

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

1. Название работы
2. Принцип метода
3. Полученные результаты
4. Выводы. Клинико-диагностическая оценка полученных результатов.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 29. 08. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено асс. Кротовым В.К.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

 

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 2

(для студентов)

 

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Ферменты: строение и свойства.

2. Учебная цель занятия: Изучить особенности строения и основные свойства ферментов, методы определения их активности.

3. Задачи занятия:

1. на основе знаний по биоорганической химии систематизировать сведения о строении и основных свойствах белков, их биологической (каталитической) роли в организме.

2. изучить строение ферментов, знать отличия в строении простых и сложных ферментов, локализацию ферментов в клетке, изоферменты.

3. познакомиться с основными методами качественного обнаружения и количественного определения активности ферментов.

4. в ходе выполнения практической работы познакомиться с методами осаждения белков, обнаружить кофермент НАД в дрожжах, исследовать амилазную активность слюны.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Изучить денатурацию белков под действием растворов минеральных и органических кислот и при нагревании.

2. Обнаружить кофермент НАД в дрожжах.

3. Определить амилазную активность в моче (сыворотке крови).

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Денатурация белков под действием кислот и при нагревании.

Принцип метода: денатурация - это нарушение структурной организации белковой молекулы, приводящее к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Большинство белков теряют биологическую активность в присутствии сильных минеральных и органических кислот, при обработке ПАВ, органическими растворителями, солями тяжелых металлов и под действием физических факторов (температура, ультразвук, радиация). Денатурации предшествует нарушение гидратной оболочки и снятие заряда белка, в силу чего он становится менее гидрофильным и легко осаждается.

Ход работы:

1). Осаждение белка минеральными кислотами.

В пробирку наливают 15-20 капель концентрированной азотной кислоты (HNO₃) и осторожно по стенке приливают равный объем раствора белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде небольшого белого кольца.

2). Осаждение белка органическими кислотами.

В пробирку наливают 5-10 капель раствора белка и добавляют 3-5 капель 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Образуется осадок белка.

3). Осаждение белка при нагревании.

В пробирку наливают 5-10 капель раствора белка и содержимое пробирки нагревают над спиртовкой, Жидкость мутнеет.

Клинико-диагностическое значение.

Осаждение белка с помощью ТХУ широко используется в клинической практике для обнаружения белка в биологических жидкостях (моча, экссудаты и др.).

В клинической практике выполнению анализа сыворотки крови на содержание малых молекул (глюкоза, мочевая кислота и т.д.) предшествует осаждение белков действием минеральных кислот или ТХУ.

Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимого осадка используется как противоядие при отравлениях солями тяжелых металлов.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

В выводах отразить причины осаждения белков из растворов, влияние денатурирующих факторов на активность ферментов.

Работа № 2. Обнаружение никотинамидадениндинуклеотида (НАД) в дрожжах.

Принцип метода: В процессе тканевого дыхания водород от оксиляемого субстрата с помощью ферментов дегидрогеназ переносится на коферменты ФАД или НАД⁺. НАД⁺ - кофермент, содержащий витамин РР, встречается во многих тканях и органах человека и животных, много его и в дрожках. Этот кофермент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуоресцирующего комплекса с ацетоном.

Ход работы: В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4-5 мм, добавляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20-З0 С, не допуская выброса жидкости. В пустую пробирку отфильтровывают 5-10 капель полученного экстракта и добавляют туда 3-5 капель ацетона, 1-2 капли раствора фенолфталеина и по каплям соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина, встряхивая при этом пробирку. Помещают пробирку на 2 мин в кипящую водяную баню, после чего вынимают, охлаждают и подносят к включенному флюорометру. Ацетоновый комплекс флюоресцирует синим цветом.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

1. Приведите структурную формулу кофермента НАД, выделив его рабочий фрагмент.

2. Напишите в общем виде реакцию дегидрирования субстрата с участием НАД⁺.

Работа № 3. Определение амилазной активности в моче (крови) методом Каравея со стойким крахмальным субстратом.

Принцип метода: α-амилаза гидролизует крахмал с образованием продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности α-амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски.

Ход работы: (микрометод). 0,5 мл субстратно-буферного раствора помещают в пробирку, нагревают 5 мин при 37˚С, добавляют 0,01 мл исследуемой биологической жидкости. Инкубируют 7,5 мин при 37˚С. Время инкубации необходимо точно отсчитывать по секундомеру с момента добавления биологической жидкости в крахмальный субстрат. Тотчас же после инкубации добавляют 0,5 мл 0,01 Н раствора йода и доводят объем дистиллированной водой до 5 мл. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) против дистиллированной воды.

Расчет. Активность α-амилазы выражают в мг или г крахмала, гидролизованного 1 л биологической жидкости за 1 с инкубации при 37˚С. Расчет проводят по формуле:

А=((Е_К-Е_О)/Е_К) • (0,2 • 10⁵/7,5 • 60) или А=((Е_К-Е_О)/Е_К) • 44,4, где

А – активность α-амилаза, мг/(с•л),

Е_К – экстинция контрольной пробы,

Е_О – экстинция опытной пробы,

0,2 – количество, крахмала введенного в опытную и контрольную пробы, мг.

10⁵ – коэффициент перерасчета на 1 с инкубации.

Нормальные значения. Сыворотка крови: 3,3-8,9 мг/(с•л), Моча: до 44 мг/(с•л).

Клинико-диагностическое значение. Повышение активности α-амилазы в крови и моче наблюдается при остром панкреатите (до 90% и более), а также при вирусном гепатите и раке поджелудочной железы. Труднообъяснимую гиперамилаземию вызывают холецистит, перитонит, ожоги, острый аппендицит. Употребление многих фармакологических препаратов (кортикостероиды, салицилаты, тетрациклин, гистамин) приводит к повышению уровня активности α-амилазы. При почечной недостаточности α-амилаза в моче отсутствует.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

Результаты работы оформите в виде таблицы:

Название фермента	α-амилаза
Исследуемый материал
Субстрат
Условия определения	фосфатный буфер; рН 7,0; 37°С (по убыли крахмала)
Найденная активность α-амилаза
Активность α-амилазы в норме
Вывод

В выводе сравните найденное значение амилазной активности с нормой и выскажите предположение о возможных причинах отклонения, если таково выявлено.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 29. 08. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено

 

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

 

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 3

(для студентов)

 

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Механизм действия ферментов.

2. Учебная цель занятия: изучить механизм действия ферментов, особенности протекания ферментативных реакций.

3. Задачи занятия:

1. Изучить общие принципы действия катализаторов и особенности ферментативного катализа.

2. Получить представления о механизме действия ферментов.

3. Получить представления об основах химической кинетики ферментативных реакций: влияния различных факторов на скорость реакции.

4. Получить представления о константе Михаэлиса и ее использовании в клинико-диагностических целях.

5. Получить представления о видах ингибирования активности ферментов, о классификации ферментов.

6. В ходе выполнения практической работы закрепить теоретические представления, изучив специфичность α-амилазы слюны, исследовав влияние рН, температуры, солей тяжелых металлов на ее активность.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Изучить специфичность фермента α-амилазы.
2. Изучить влияние рН на активность α-амилазы.
3. Исследовать влияние температуры на активность α-амилазы.
4. Изучить влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы.

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Специфичность фермента α-амилазы.

Принцип метода: Специфичностью действия ферментов называется их способность катализировать только определенные химические реакции. Например, α-амилаза ускоряет гидролиз крахмала, но не виляет на скорость гидролиза сахарозы.

Ход работы:

1. В две пробирки вносят по 5-10 капель слюны, разведенной в 10 раз.

2. В одну из пробирок добавляют 10 капель крахмала, в другую – 10 капель раствора сахарозы.

3. Обе пробирки помещают на 10 мин в термостат при 40°С.

4. Затем содержимое первой пробирки разливают пополам и проделывают в одной пробирке реакцию с йодом, а в другой – с реактивом Фелинга. Отмечают результат.

5. В пробирку с раствором сахарозы добавляют реактив Селиванова и нагревают содержимое, в пламени спиртовки. Если сахароза не гидролизовалась, качественная реакция на фруктозу будет отрицательной.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

Полученные результаты оформите в виде таблицы № 1.

Таблица 1

Определение специфичности действия α-амилазы

Субстрат	Контрольные реакции
Йод-крахмальная проба	Реакция с реактивом Фелинга	Реакция Селиванова
Крахмал
Сахароза

В выводах отметить, почему α-амилаза расщепляет крахмал, но не действует на сахарозу.

Изобразить фрагмент макромолекулы амилопектина, указать тип гидролизуемой связи.

Работа № 2. Влияние рН на активность ферментов.

Принцип метода: Оптимум рН α-амилазы слюны, при котором она обладает максимальной каталитической активностью – 6,6-6,8, что соответствует значению рН в ротовой полости. Сдвиг рН в кислую или щелочную сторону приводит к инактивации фермента.

Об изменении активности слюнной α-амилазы судят качественно по уменьшению интенсивности окраски раствора после добавления йода в инкубационную среду.

Ход работы:

1. Получают слюну, разведенную в 10 раз.

2. В три пронумерованные пробирки наливают из бюреток по 1 мл буферного раствора со значением рН соответственно 4,0; 7,0; 10,0.

3. Добавляют в каждую из пробирок последовательно по 2 мл 0,1% раствора крахмала и по 1 мл слюны.

4. Пробирки помещают в термостат с температурой 45°С на 15 мин.

5. После инкубации в каждую из пробирок добавляют по 1 капле раствора йода. Отмечают результат.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

1. Сравнив окраску растворов в пробирках, ответьте, почему по ее изменению можно судить о степени расщепления крахмала под действием α-амилазы?

2. Сделайте вывод, при каком значении рН активность α-амилазы наибольшая, как изменяется активность с изменением pH среды.

3. Объясните, почему активность ферментов зависит от среды.

Работа № 3. Влияние температуры на активность α-амилазы слюны.

Принцип метода: Температура, при которой наблюдается максимальная активность фермента называется оптимальной. Для большинства ферментов организма человека она равна 35-40°С. При более высоких температурах, как и при более низких, скорость ферментативных процессов падает.

Ход работы:

1. Получают слюну, разведенную в 10 раз.

2. В три пронумерованные пробирки вносят по 10 капель слюны и 10 капель 0,1% раствора крахмала, помещают первую в кипящую водяную баню, вторую - при 37°С, а третью ставят на лед.

3. Через 5-7 мин все пробирки ставят в штатив, добавляют в каждую по 1 капли йода и отмечают результат. В пробирках, где α-амилаза не подействовала, крахмал окрашивается в синий цвет.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

Полученные результаты оформите в виде таблицы № 2.

Таблица 2

Влияние температуры на активность α-амилазы слюны

№ пробирки	Температура, °С	Окраска с йодом

На основании анализа данных таблицы сделайте вывод, какая температура является оптимальной для действия α-амилазы.

Объясните, с чем связано уменьшение ферментативной активности при температурах 0°С и 100°С?

Работа № 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы слюны.

Принцип метода: Каталитическое действие ферментов может усиливаться некоторыми веществами, которые называются активаторами. Вещества, тормозящие активность ферментов, называются ингибиторами. Часто активирующее или тормозящее действие оказывают ионы металлов.

Ход работы:

1). Берут 3 пробирки и вносят в них реагенты в соответствии с таблицей № 3.

Таблица 3

Объем (в каплях) и последовательность внесения реактивов

Реагент	Пробирки
вода
1% NaCl	-		-
1% CuSO4	-	-
р-р слюны, разведенный в 10 раз
0,5% р-р крахмала

2). Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре.

3). В каждую пробирку добавляют по 1 капли раствора йода, отмечают окрашивание.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

Полученные результаты оформите в виде таблицы № 4.

Таблица 4

Действие активаторов и ингибиторов на α-амилазу слюны

№ пробирки	Фермент	Субстрат	Окраска раствора после добавления йода в присутствии:
Н2О	NaCl	CuSO4
	α-амилаза	крахмал
	α-амилаза	крахмал
	α-амилаза	крахмал

Проанализировав данные таблицы № 4, сделайте вывод о влиянии исследованных солей на активность α-амилазы. Выскажите предположение о возможном механизме их действия.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 13. 09. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

 

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 5

(для студентов)

 

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Медицинская энзимология.

2. Учебная цель занятия: Сформировать представления об основных направлениях и принципах медицинской энзимологии.

3. Задачи занятия:

1. Получить представления о классификации энзимопатий, о молекулярных механизмах их возникновения, развития и последствиях.
2. Изучить основные принципы и направления энзимодиагностики и использования ферментов в качестве аналитических реагентов.
3. Получить представления о современных подходах и перспективах энзимодиагностики, ее механизмах действия и областях применения.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

Итоговый тест-контроль по теме: «ферменты»

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 18. 09. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено

 

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

 

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 6

(для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Общие представления о биологическом окислении, ЦТК.

2. Учебная цель занятия: Сформировать общие представления об этапах биологического окисления и реакциях цикла Кребса.

3. Задачи занятия:

1. Рассмотреть: историю развития учения о биологическом окислении (Лавуазье, Бах, Палладин и др.), этапы утилизации энергии химических связей питательных веществ, реакции, регуляцию и энергетический баланс ЦТК.
2. Выполнить самостоятельную лабораторную работу по качественному определению цитрата и сукцината, сделать вывод о клиническом значении их определения.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Качественное определение цитрата и сукцината флуориметрическим методом

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Качественное определение цитрата и сукцината флуориметрическим методом.

Принцип метода: Ди- и трикарбоновые кислоты, карбоксильные группы которых разделены не более чем двумя атомами углерода (НООС-СR₂-СR₂-СООН), при взаимодействии с резорцином в присутствии серной кислоты образуют флуоресцирующие продукты.

Реактивы: кристаллы цитрата, сукцината и резорцина, конц. серная кислота, дистиллированная вода. Посуда: пробирки, капельницы, склянки. Оборудование: горелка, флуороскоп.

Ход работы: 1. В две пробирки (№1, 2) внести реактивы (см. таблицу №1).

Таблица 1

№	Исследуемая кислота	Н2О, капли	Н2SO4, капли	Резорцин	Результат (цвет), формула исследуемой кислоты	Выводы
	Цитрат, несколько кристаллов	1-2	10-12	Несколько кристаллов
	Сукцинат, несколько кристаллов	1-2	10-12	Несколько кристаллов

2. Осторожно нагреть содержимое пробирок у мениска жидкости, поворачивая пробирку в пламени горелки.

3. Охладить на воздухе содержимое пробирок и добавить в каждую по 2 мл воды.

4. Отметить цвет (соблюдая меры предосторожности) флуоресценции раствора в ультрафиолетовом свете.

5. Записать формулы кислот, цвет флуоресценции и вывод.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 18. 09. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено ст. преп. Клубникиной Н.С.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

 

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 7

(для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Пути использования кислорода в клетке.

2. Учебная цель занятия: Изучить пути и механизмы использования кислорода в клетках организма.

3. Задачи занятия:

1. Разобрать оксидазный путь потребления кислорода в тканях и механизмы сопряжения и разобщения окислительного фосфорилирования.

2. Изучить моно- и диоксигеназные пути использования кислорода в тканях.

3. Ознакомиться с механизмами образования активных форм кислорода и антиоксидантной защиты.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Качественное определение сукцинатдегидрогеназы (СДГ).

2. Количественное определение активности каталазы по Баху и Зубковой.

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Качественное определение сукцинатдегидрогеназы (СДГ).

Принцип метода:

При добавлении в среду окисленной формы метиленовой синей, восстановленная СДГ передает водород на метиленовую синь, образуя бесцветное соединение. Критерием активности СДГ является время обесцвечивания метиленовой сини в присутствии янтарной кислоты в анаэробных условиях.

Реактивы: гомогенат мышечной ткани, фосфатный буфер, растворы кислот (янтарная, малоновая), метиленовая синь, дистиллированная вода. Посуда: пробирки, бюксы, центрифужные пробирки, пипетки, бюретки. Оборудование: термостат, центрифуга, микродозаторы.

Ход работы:

Источником СДГ является супернатант мышечной ткани, содержащий митохондрии. Для получения супернатанта в бюкс с гомогенатом мышечной ткани добавляют 3 мл фосфатного буфера (рН=6,8), тщательно перемешивают и центрифугируют 5 мин (3000 об/мин).

В три пробирки (№ 1, 2, 3) вносят реактивы (см таблицу №1).

 

 

Таблица 1

№	Супернатант, мл	Н2О, мл	Янтарная кислота, мл	Малоновая кислота, мл	Метиленовая синь, капли	Результат (цвет)	Выводы
	0,1	2,0	-	-
	0,1	1,5	0,5	-
	0,1	1,0	-	0,5

Содержимое пробирок термостатируют 3-5 минут при 37ºС.

Рекомендации по оформлению результатов работы и написанию выводов

СДГ интенсивно окисляет сукцинат, при заболеваниях, сопровождаемых или вызванных гипоксией, увеличивая, таким образом, генерацию АТФ, снимая энергетический дефицит в тканях. Янтарная кислота применяется как лекарственный препарат при гипоксиях.

Ход работы

Реактивы	Опыт	Контроль
Н2О	-	3мл
Н2О2	3мл	-
Сыворотка	0,1мл	-
Инкубация 37С	10мин	-
(NH4)2MoO4	2мл	2мл

Определение оптической плотности при 410нм (синий светофильтр)

Формула расчета:

Е= (Еопыт-Еконтр) * V*t*K

где V – 0,1 мл сыворотки;

t – время инкубации – 600сек

K – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси 22,2

Биологическое значение

Каталаза является компонентом ферментативной антиоксидантной системы, она тормозит свободно-радикальные реакции, протекающие в организме.

Литература

М.А. Королюк и др. «Лабораторное дело» М.Медицина. 1988 №1. с.16-18.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 24. 10. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено ст. преп. Кротов В.К.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

 

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 8

(для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Биохимические механизмы переваривания, всасывания углеводов и обмена гликогена.

2. Учебная цель занятия: Ознакомиться со структурой, функцией, принципами нормирования суточной потребности углеводов, биохимическими механизмами их переваривания, всасывания и тканевого обмена гликогена.

3. Задачи занятия:

1. Повторить номенклатуру, классификацию, строение, свойства, биологическую роль углеводов.

2. Изучить принципы нормирования суточной потребности углеводов.

3. Разобрать биохимические механизмы переваривания, всасывания углеводов и обмена гликогена.

4. Разобрать причины и механизмы мальабсорбции углеводов и гликогеновых болезней.

5. Получить навыки проведения экспериментальной работы по экстрагированию гликогена из ткани животного, его ферментативного расщепления и обнаружения убыли фосфорной кислоты, доказывающей течение фосфоролиза.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Экстрагирование гликогена из печени крысы и его качественное обнаружение.

2. Фосфоролиз гликогена и качественное обнаружение фосфорной кислоты.

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Работа № 1. Выделение гликогена из печени сытого и голодного животного.

Принцип метода: Метод основан на хорошей растворимости гликогена в воде и устойчивости к гидролизу в слабокислой среде. Поэтому гликоген легко экстрагируется слабокислым раствором ТХУ кислоты из разрушенных гомогенизацией тканей.

1. Подготовка экспериментальных животных.

За сутки до начала эксперимента отсаживается две одинаковых по возрасту и массе крысы – контрольная и опытная. Опытную крысу прекращают кормить, голодную продолжают в обычном режиме.

2. Получение препарата печени для экстракции гликогена.

Через сутки от начала эксперимента крыс забивают, быстро извлекают печень, каждую из них делят на две части. Одна часть печени голодной крысы помещается в холодный физ р-р для использования её в качестве источника активного фермента – гликогенфосфорилазы. Другая часть печени обеих крыс измельчается тонкими пластиками и каждая помещается в отдельный стаканчик с кипящим физ р-ром на 5 минут для инактивации ферментов.

Оба этапа проводят лаборанты или студенты (по желанию) в виварии и операционном блоке кафедры.

Последующие этапы эксперимента проводятся на практическом занятии в учебных

лабораторных комнатах группами студентов по 4 человека, из них двое выполняют работу № 1, c пункта 2 – получение экстрактов гликогена. Другие двое работу № 2.см ниже.

3. Получение экстрактов гликогена.

1) Навески печени голодного и сытого животного растереть в двух ступках с 3 мл 3% раствора ТХУ кислоты до гомогенного состояния.

2) К полученным экстрактам добавить по 4 мл Н₂О, всё перемешать и профильтровать в две промаркированные пробирки через смоченные водой фильтры.

3) В полученных фильтратах обнаружить наличие гликогена как указано в таблице.

Реагенты (мл).	Пробирки
Оп 1	Оп 2	Контроль
Н2О	1,0
Фильтрат гликогена печени сытой крысы		1,0
Фильтрат гликогена печени голодной крысы			1,0
Р – р Люголя (капли)
Окраска

Сравнить окраску и сделать вывод о содержании гликогена в печени голодного и сытого животного, объяснить полученный результат.

Работа № 2. Фосфоролиз гликогена и открытие фосфорной кислоты.

Ход работы:

1. Извлечение активного фермента - гликогенфосфорилазы.

0,5 г сырой печени поместить в ступку, добавить 4 мл фосфатного буфера и 4 мл р-ра NaF, (для предотвращения утилизации Гл1ф), растереть пестиком до гомогенного состояния, при этом фермент перейдет в раствор.

Проведение фосфоролиза.

В две чистые пробирки поместить по 2 мл гомогената, содержащего активный фермент. В первую пробирку(опыт) добавить 2 мл фильтрата или раствора гликогена, во вторую пробирку (контроль) добавлять ничего не нужно.

Обе пробирки термостатировать в течение 40 минут при температуре 39 градусов. В это время в опытной пробирке идет фосфоролиз с использованием фосфорной кислоты, а в контрольной нет, так как она не содержит субстрата – гликогена.

По истечении инкубационного времени в контрольную пробирку внести 2 мл р-ра

гликогена и в обе пробирки по 2 мл 20% раствора ТХУ к-ты. Все оставить на 5 мин.

при комнатной температуре для