Неспецифическое повышение ферментативной активности

При интерпретации результатов анализа следует иметь ввиду, что повышение активности ферментов в сыворотке может быть неспецифическим, то есть может быть связано с наличием неспецифического физиологического или патологического процесса. Так, например, тяжёлая физическая работа, массивные внутримышечные инъекции могут привести к повышению активности КК. Некоторые лекарственные средства, в частности фенобарбитал могут индуцировать синтез микросомального фермента гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ) и вызвать его повышение в сыворотке без всякого заболевания. Активность ферментов в сыворотке может меняться в результате агрегации с образование макромолекул, например, при образовании комплексов с иммуноглобулинами, в которые вступают ЛДГ, ЩФ и КК.

 

Применение ферментов в качестве аналитических реагентов

 

Высокоочищенные ферменты часто используют в качестве избирательных реагентов для количественного определения (с диагностической целью) нормальных или аномальных химических веществ в биологических жидкостях (моча, кровь, желудочный сок и др.). Так, например, фермент уреазу используют для измерения количества мочевины в моче или в крови. Уреаза – это фермент с абсолютной специфичностью, под её действием мочевина распадается на углекислоту и аммиак:

 

О ║			уреаза
NH2 ─ С ─ NH2	+	H2O	→	2NH3	+	CO2
мочевина				аммиак

 

Достаточно обработать пробу крови или мочи раствором уреазы и определить количество образовавшегося аммиака, чтобы точно сказать, сколько мочевины содержалось во взятой пробе.

Также в лабораториях широко используют очень простой и точный метод определения глюкозы в крови и моче с помощью фермента глюкозооксидазы. Принцип метода основан на специфическом окислении глюкозы под влиянием глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4), обладающий высокой субстратной специфичностью по отношению к глюкозе.

 

D-Глюкоза		D-глюконовая кислота
О ║ C─H ô Н─C─ОH ô ОH─C─Н ô Н─C─ОH ô Н─C─ОH ô СН2ОН	глюкозооксидаза	CООH ô Н─C─ОH ô ОH─C─Н ô Н─C─ОH ô Н─C─ОH ô СН2ОН

 

Этот метод позволяет определить содержание глюкозы в крови в присутствии других восстанавливающих веществ. Глюкозооксидаза – флавопротеин, простетической группой которого является FAD⁺. Окисление глюкозы глюкозооксидазой происходит у первого углеродного атома до глюконовой кислоты через промежуточный продукт δ-глюконолактон. Перенос двух атомов водорода на FAD⁺ приводит к его восстановлению, а затем FADH₂ передает их на кислород с образованием перекиси водорода в эквимолярных количествах. Образовавшийся пероксид водорода определяется по реакции окислительной конденсации хлорпроизводного фенола с 4-аминофеназоном, катализируемой пероксидазой. Интенсивность возникшей окраски прямо пропорциональна концентрации глюкозы.

Обнаружение самих ферментов при поражении органов и тканей

 

В настоящее время известно более 30-ти ферментов, активность которых в крови увеличивается при повреждении клеток различных органов в период острого или хронического заболевания. Определение активности большинства из этих ферментов в сыворотке крови используется для диагностики многих заболеваний и контроля за лечением (табл. 5.2.1).

 

Таблица 5.2.1

Некоторые ферменты, используемые в клинике для диагностики

Фермент	Локализация в клетке	Заболевания, при которых фермент наиболее активен в крови
Аланинаминотрансфераза	Цитозоль	Гепетиты, цирроз
Аспартатаминотрансфераза	Цитозоль, митохондрии	Инфаркт и другие заболевания сердца, гепатиты, заболевания почек
Амилаза	Цитозоль	Острый панкреатит
Креатинкиназа(изоферменты)	Цитозоль, митохондрии	Инфаркт миокарда, заболевания скелетных мышц
Лактатдегидрогеназа(изоферменты)	Цитозоль	Инфаркт миокарда, гепатиты, рак печени
γ-глутамилтранспептидаза	Цитоплазматическая мембрана	Гепатиты, цирроз, алкогольное поражение печени
Липаза панкреатическая	Цитозоль	Острый панкреатит, рак поджелудочной железы
Кислая фосфатаза (рН 4,9)	Лизосомы	Метастазирующая карцинома предстательной железы, аденома предстательной железы
Щелочная фосфатаза (рН 10,0) (изоферменты)	Плазматическая мембрана	Заболевания костей, цирроз и новообразования печени, закупорка протоков печени
Фермент	Локализация в клетке	Заболевания, при которых фермент наиболее активен в крови
Глутаматдегидрогеназа	Митохондрии	Острые гепатиты (некротические формы), печёночная кома
Лейцинаминопептидаза	Цитозоль	Цирроз, гепатит, рак поджелудочной железы
5`-нуклеотидаза	Плазматическая мембрана	Механическая желтуха, цирроз, метастазы в печени
Сорбитолдегидрогеназа	Цитозоль	Гепатиты, желтухи
Псевдохолинэстераза	Цитозоль	Нефроз, сахарный деабет II типа, алкоголизм
Гистидаза	Цитозоль	Поражения печени

 

Лактатдегидрогеназа

 

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ, L-лактат: NAD-оксидоредуктаза; К.Ф. 1.1.1.27) – цитоплазматический, Zn-содержащий гликолитический фермент, обратимо катализирующий восстановление пировиноградной кислоты в молочную кислоту:

 

 

Фермент широко распространён в организме человека. По степени убыли активности ЛДГ органы и ткани можно расположить в следующей последовательности: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезёнка, печень, лёгкие, сыворотка крови. ЛДГ содержится в значительном количестве в эритроцитах, поэтому исследуемая сыворотка не должна содержать следов гемолиза. ЛДГ имеет пять изоферментов, представляющих различные комбинации из четырёх субъединиц двух основных типов – Н (от англ. heart – сердце) и М (от англ. muscle – мышца):

ЛДГ₁ – 4Н;

ЛДГ₂ – 3Н1М;

ЛДГ₃ – 2Н2М;

ЛДГ₄ – 1Н3М;

ЛДГ₅ – 4М.

Изоферменты ЛДГ нумеруются в соответствии с электрофоретической подвижностью по направлению к аноду (рис. 5.2.2). На рисунке показано распределение и относительное количество изоферментов ЛДГ в различных органах. Экстракты нанесены на линию, отмеченную надписью «Старт». При заданных условиях опыта (рН) 4 изофермента ЛДГ движутся к аноду, а один (ЛДГ₅) к катоду.

 

Рис. 5.2.2 Распределение и относительное количество изоферментов ЛДГ в различных органах

 

Протекание прямой реакции превращения пирувата в лактат обеспечивает М субъединица ЛДГ, протекание обратной реакции – Н субъединица (рис. 5.2.3).

 

Рис. 5.2.3. Обратимая реакция превращения пирувата в лактат, катализируемая ЛДГ

 

Изоферментный спектр и тип обмена веществ в ткани коррелируют между собой. Так, в тканях с преимущественно аэробным обменом веществ (мозг, сердце, почки и др.) наибольшей активностью обладают ЛДГ₁ и ЛДГ₂, в тканях с выраженным анаэробным обменом веществ (печень, скелетная мускулатура и др.) преобладают ЛДГ₄ и ЛДГ₅. Наиболее высокое содержание ЛДГ₃ отмечают в лимфоидной ткани, тромбоцитах и опухолях. Это распределение имеет большой биологический смысл. Изофермент ЛДГ₁ in vitro активен при низкой концентрации пирувата и ингибируется его избытком, в то время как ЛДГ₅ сохраняет активность при сравнительно высоких концентрациях пирувата. Поскольку восстановление пирувата в лактат, катализируемое ЛДГ₁, сильно ингибируется уже небольшими концентрациями пирувата, то в ткани, богатой этим изоферментом, например в сердце, пируват подвергается преимущественно аэробному окислению. Кроме активной переработки собственного (эндогенного) лактата, сердечная мышца способна поглащать лактат из крови, затем превращать его в пировиноградную кислоту и подвергать дальнейшему окислению для пополнения запасов АТР. С другой стороны, в тканях, где преобладают изоферменты ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (печень, скелетная мускулатура), АТР в значительной степени образуется за счёт гликолиза. Высокая активность ЛДГ₅ в них обеспечивает быстрое превращение пирувата в лактат, который затем выбрасывается в кровь, поскольку в скелетной мускулатуре дальнейшее превращение лактата почти не осуществляется. Однако в некоторых тканях нет зависимости между типом обмена и изоферментным спектром. Так в эритроцитах, тромбоцитах, хрусталике глаза, где преобладает анаэробный обмен, фермент представлен в основном изоферментами ЛДГ₁ ЛДГ₂.

Молекулярная масса каждой изоформы ЛДГ составляет 135 кДа (по другим данным 140 кДа), а каждой субъединицы – 34 кДа (по другим данным – 33,5 кДа). Вместо лактата ЛДГ может окислять α-гидроксибутират до α-оксибутирата. Особенно высокую активность в отношении α-гидроксибутирата по сравнению с лактатом проявляет ЛДГ₁. Вследствие этого ЛДГ₁ обычно измеряют с использованием именно этого субстрата, а данный изофермент (ЛДГ₁) имеет второе название – α-гидроксибутиратдегидрогеназа (α-ГБДГ).

Соотношение между изозимами ЛДГ, по данным разных авторов при электрофорезе на ацетатцеллюлозных плёнках составляет у взрослых:

 

ЛДГ1	19-29%
ЛДГ2	23-27%
ЛДГ3	17-25%
ЛДГ4	8-17%
ЛДГ5	8-18%

 

Это соотношение может изменяться как при адаптации к меняющимся условиям среды, так и в ходе онтогенеза. Эмбрионы всех млекопитающих проходят стадию развития, когда митохондрии ещё не готовы к окислению субстратов. В этих условиях особенно велика роль анаэробного гликолиза. Как показано для развивающихся мышей, на стадии эмбриона основной формой фермента является тетрамер типа М₄. После рождения постепенно нарабатываются другие формы ЛДГ, и к периоду, соответствующему взрослому организму, устанавливается соотношение разных изоформ, типичное для каждой ткани.

 

Клиническое значение определения ЛДГ

 

Рост общей активности ЛДГ сыворотки крови не несёт достаточно специфической информации. Можно отметить, что общая активность ЛДГ резко повышена при миелобластных и пернициозных анемиях, обширных опухолевых процессах, вирусных гепатитах, шоке и гипоксии. Выраженное повышение наблюдается при циррозах печени, обтупационных желтухах, заболеваниях почек, опорно-мышечного аппарата, опухолях, при сердечной недостаточности. Активность фермента повышается при любых патологических процессах, связанных с цитолизом клеток органов и тканей (например, при инфарктах миокарда, лейкозах, гемолитических анемиях, гепатитах и др.). Определение отдельных изоферментов ЛДГ в сыворотке крови имеет большую диагностическую значимость, чем определение суммарной активности.

Активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂ увеличивается при инфаркте миокарда, различных видах анемий, острых поражениях (некрозах) почечной ткани. Уровень ЛДГ₁ повышается при опухолевых заболеваниях яичников. Повышение активности ЛДГ₅ выявляется при повреждении скелетных мышц, любых воспалительных или дегенеративных заболеваниях скелетных мышц, многих заболеваниях печени (циррозе, всех типах гепатитов) и при раковых опухолях. Повышение активности изоферментов средней зоны, то есть ЛДГ₂ и ЛДГ₃ ЛДГ₄ встречается при массивном разрушении тромбоцитов (эмболия лёгочной артерии, массивная гемотрансфузия) и вовлечении в патологический процесс лимфатической системы, например, при таких заболеваниях, как инфекционный мононуклеоз, лимфомы, лимфоцитарный лейкоз.

У здоровых новорожденных, в первые дни жизни содержание ЛДГ₂ ниже, а содержание ЛДГ₅ выше чем у взрослого человека. Максимальная активность фермента наблюдается на 2-4 день жизни. К 6-7 годам соотношение фракций ЛДГ примерно соответствуют таковому у взрослого человека.

Рекомендации по определению ЛДГ:

1. Сыворотка не должна быть гемолизирована, так как ЛДГ содержится в эритроцитах и результаты могут быть завышены;

2. Не рекомендуется использовать в качестве антикоагулянта оксалаты, так как соли щавелевой кислоты являются ингибиторами лактатдегидрогеназной реакции;

3. Рекомендуется использовать свежую сыворотку или плазму крови, лучше плазму, так как ЛДГ много в тромбоцитах и при их разрушении активность ЛДГ повышается.

 

ЛЕКЦИЯ 5.3