Метаболические пути, созданные методами генной инженерии

В настоящее время предложено создание генно-инженерных систем не просто экспрессирующих отдельные рекомбинантые ферменты, но систем, включающих несколько рекомбинантых ферментов и даже небольшой метаболический путь. Такая задача стала особенно актуальной с развитием молекулярной биотехнологии. Так, усилия по созданию искусственных метаболических путей направлены на создание систем биодеградации ксенобиотиков. Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных ксенобиотиков, однако эти природные способности имеют определенные ограничения для использования в промышленных масштабах. Микроорганизмы обладают способностью разрушать только определенные ксенобиотики; биодеградация часто происходит довольно медленно; в большинстве очагов загрязнения содержится смесь ксенобиотико и микроорганизмы, способные разрушать одни вещества, могут инактивироваться другими.

Задача создания искусственного метаболического пути может решаться двумя путями:

· объединением нескольких рекомбинантных ДНК в одной клетке;

· объединением нескольких генов в одной рекомбинантной ДНК.

Объединение плазмид

Эксперименты по созданию бактериальных штаммов обладающих широкими катаболическими возможностями заключаются в переносе в клетки плазмид, каждая из которых кодирует фермент, расщепляющий определенный класс углеводородов – камфары, октана, нафталина, ксилола. Такие «супербациллы» успешно создаются. Так, был получен штамм, который растет на неочищенной нефти лучше исходных штаммов, взятых по отдельности или вместе.

Объединение нескольких генов в одной рекомбинантной ДНК

Работы по созданию генно-инженерных систем для утилизации тех или иных субстратов позволяют объединять в рамках одной рекДНК нескольких генов, кодирующих ферменты расщепления этого субстрата. При этом эти гены могут быть как бактериального, так и животного и растительного происхождения. Таким образом может быть создан метаболический путь, который не существует в природе.

Одним из примеров может служить создание рекомбинантного штамма E.coli, синтезирующего краситель индиго. Этот краситель широко используется в текстильной промышленности, в частности для окрашивания джинсовой ткани и является одним из самых востребованных красителей. В экспериментах по соединению в одной рекомбинантной системе генов утилизации нафталина, толуола и фенола удалось получить штамм, который окрашивался в синий цвет. Оказалось, что рекомбинантный штамм способен синтезировать индиго из триптофана в 4 стадии. Таким образом, этот неожиданный результат был получен объединением 2-х метаболических путей.

Создание рекомбинантных микроорганизмов с новой ферментативной активностью

Основной целью создания рекомбинантных микроорганизмов с новой ферментативной активностью, способного превращать существующий субстрат в ценный продукт, который ранее получали только сочетанием микробиологического и химического синтеза. Например, производство L-аскорбиновой кислоты (витамина С), синтез аминокислот, антибиотиков, микробиологического синтеза каучука и других веществ.

Производство L-аскорбиновой кислоты (витамина С) – трудоемкий процесс, включающий микробиологическую и химическую стадии. Биохимические исследования показали, что одни бактерии могут превращать глюкозу в 2,5-дикетоглюконовую кислоту (Erwinia, Acetobacter, Gluconobacter), а другие (Corynebacterium) могут превращать 2,5-дикетоглюконовую кислоту в кетогулоновую, т.к. экспрессирует соответствующую редуктазу. Создание рекомбинантного штамма позволило объединить два метаболических пути в одном: ген редуктазы дикетоглюконовой кислоты из Corynebacterium был клонирован и применен для трансформации клеток Erwinia.

ЛЕКЦИЯ 5.2

Ферменты в медицине (ЧАСТЬ i)

 

Практическое использование достижений энзимологии можно найти во всех областях деятельности человека. Ферменты используются в лёгкой, пищевой, микробиологической, фармацевтической промышленности, а также в генноинженерных исследованиях и биотехнологии. Успехи энзимологии находят всё большее применение в медицине.

Медицинская энзимология – новое направление энзимологии, которая имеет свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы исследований.

Медицинская энзимология развивается по трём направлениям:

1. Энзимодиагностика, которая в свою очередь развивается по двум путям:

а) применение высокоочищенных ферментов в качестве избирательных реагентов для количественного определения (с диагностической целью) нормальных или аномальных химических веществ в биологических жидкостях (моча, кровь, желудочный сок и др.);

б) обнаружение (открытие) самих ферментов при поражении органов и тканей.

2. Изучение таких болезней, причина которых лежит в отсутствии или недостаточности тех или иных ферментов – энзимопатологии или энзимопатии.

3. Энзимотерапия – использование ферментов и регуляторов активности ферментов в качестве лекарственных препаратов.

 

Энзимодиагностика

 

Органная специфичность в распределении ферментов

 

Дифференцировка клеток на органы и ткани сопровождается биохимическими изменениями в них. В результате таких изменений каждый орган и ткань имеют специфический белковый (в том числе ферментный) состав. Многие ферменты широко распространены в разных тканях, но в различных количествах. По увеличению активности таких ферментов трудно судить о локализации первичных патологических изменений, это неспецифические ферменты. Есть и такие ферменты, которые активны только в одном или нескольких органах и фактически отсутствуют во всех других. Это органоспецифические ферменты, они наиболее информативны, так как увеличение их активности свидетельствует о поражении соответствующих органов. Например, известно всего два фермента, которые находятся только в одном органе – в печени – это орнитинкарбамоилтрансфераза (КФ 2.1.3.3) и урокиназа (КФ 4.2.1.49). Для двух органов специфичны гистидаза (КФ 4.3.1.3) – в печени и эпидермисе, трансамидиназа (КФ 2.1.4.1.) – в почках и поджелудочной железе, креатинкиназа (КФ 2.7.3.2) – в сердечной и скелетной мышцах, гунидинацетат-метилтрансфераза (КФ 2.1.1.2) – в печени и поджелудочной железе. Кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2) очень активна в предстательной железе и малоактивна (до 10% от максимума) в других органах.

 

Ферменты сыворотки крови

 

Большинство ферментов находится во внутриклеточной среде (в цитоплазме и органеллах). Тем не менее, о скорости синтеза ферментов и об интенсивности выхода из клеток можно судить по их активности в биологических жидкостях (кровь, слюна, ликвор и др.). Наиболее важным в диагностическом процессе является исследование ферментов плазмы крови. Ферменты, которые обнаруживаются в норме в плазме или в сыворотке крови условно можно разделить на три группы: секреторные, индикаторные и экскреторные. Секреторные ферменты синтезируются в печени, в норме выделяются в плазму крови, где играют определённую физиологическую роль. Например, это ферменты, участвующие в процессе свёртывания крови. Индикаторные (клеточные) ферменты попадают в кровь из тканей, где они выполняют определённые внутриклеточные функции (например, лактатдегидрогеназа, альдолаза и др.). Уровень их сывороточной активности зависит от содержания энзимов в тканях, молекулярной массы, внутриклеточной локализации, прочности связи фермента со своей органеллой, а также от скорости гидролитического разрушения и элиминации. Большая часть индикаторных ферментов в норме определяется в сыворотке крови лишь в следовых количествах. При поражении тех или иных тканей ферменты из клеток «вымываются» в кровь, их активность в сыворотке резко возрастает и таким образом, является индикатором степени и глубины повреждения этих тканей. Клеточные ферменты принято делить на неспецифические и органоспецифические (см. выше). Экскреторные ферменты образуются пищеварительными железами и из их секретов поступают в кровь. К ферментам этой группы можно отнести амилазу, липазу, трипсин и др.

Существует другая классификация сывороточных ферментов, по которой их делят на функциональные и нефункциональные. Функциональные ферменты – те ферменты, которые в норме постоянно циркулируют в крови человека и выполняют физиологические функции. К ним относят, например, проферменты компонентов свёртывающей и противосвёртывающей систем крови. Эти ферменты синтезируются в печени, их концентрация в крови такая же, как в тканях, или более высокая. Нефункциональные ферменты плазмы известных физиологических функций в крови не выполняют, их субстраты в плазме не обнаруживаются. Активность нефункциональных ферментов в норме в крови очень мала. Например, это ферменты, выделяемые эндокринными железами: панкреатическая амилаза и липаза, щелочная фосфатаза (из желчи), кислая фосфатаза (из предстательной железы). Причинами появления нефункциональных ферментов в плазме крови являются нормальные процессы разрушения клеток (эритроцитов, лейкоцитов и др.) и удаление ферментов из внеклеточной жидкости путём инактивации и деградации или экскреции.