Генетическая инженерия ферментов

 

Генетическая инженерия ферментов представляет собой искусственное создание ферментов с использованием методов генной инженерии: технологий рекомбинантных ДНК или молекулярного клонирования. С помощью генетической инженерии могут создаваться:

· ферменты, называемые рекомбинантными ферментами (аналогичные природным либо модифицированные);

· клетки, экспрессирующие ферменты, – рекомбинантные клетки (фермент может быть необходим не в изолированном виде, а в виде экспрессирующих его клеток);

 

Технологии рекомбинантных ДНК

Основу генной (или генетической) инженерии составляют технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантные ДНК – это искусственно созданные молекулы ДНК, представляющие собой гены (фрагменты ДНК), встроенные в специальные молекулы ДНК (векторы), которые могут обеспечить увеличение копий гена, а также его экспрессию. Умножение гена происходит вместе с делящимися клетками ‒ клоном, несущим рекДНК, поэтому технологии рекомбинантных ДНК также называют молекулярным клонированием.

 

Основные этапы молекулярного клонирования

Основными этапами молекулярного клонирования являются следующие процедуры:

Создание рекДНК	1) получение гена, кодирующего фермент;
2) вставка гена в вектор;
Клонирование	3) трансформация клеток рекомбинантными ДНК;
4) отбор клонов;
5) функционирование гена в клетке-реципиенте (адаптация и экспрессия гена)

 

Кроме перечисленных основных этапов могут присутствовать и дополнительные. Так ген, кодирующий фермент, может быть подвергнут модификациям, в частности, сайт-специфическим изменениям с целью изменения свойств фермента. В процессе создания экспрессионной системы могут быть использован ряд подходов для увеличения эффективности экспрессии – оптимизация экспрессии клонированных генов.

Последний этап молекулярного клонирования зависит от его целей. Если конечным продуктом является сам фермент, то он выделяется из клеток и подвергаться очистке. Может также использоваться реакция, катализируемая ферментом в виде рекомбинантных клеток.

В зависимости от того, какие клетки используются для молекулярного клонирования, выделяют прокариотические и эукариотические системы. Эти системы различаются используемыми векторами и регуляторными элементами. Прокариотические системы более просты. Поэтому, если применение клонирования в бактериальных клетках возможно, то предпочтительно используются они. Однако из-за специфических особенностей экспрессии синтеза эукариотических ферментов часто прокариотические системы использовать невозможно. В таких случаях необходимы эукариотические системы.

На сегодняшний день генетическая инженерия представляет быстро развивающуюся область науки и технологий и ее рассмотрению может быть посвящен целый отдельный курс. Поэтому нижеприведенное описание этапов генно-инженерных манипуляций представляет собой только краткое их описание.

 

Получение гена, кодирующего фермент

Необходимый ген, кодирующий фермент может быть получен несколькими способами:

· химическим синтезом,

· синтезом методом ПЦР (полимеразной цепной реакции),

· выделением из геномной ДНК,

· синтезом с мРНК.

Синтезировать химическим путем удается относительно небольшие фрагменты ДНК, кодирующие небольшое число аминокислот. С разработкой и внедрением ПЦР этот метод стал все более активно использоваться и для синтеза генов.

Получение гена из геномной ДНК производится с использованием сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции, называемых рестриктазами. Эти ферменты сыграли огромную роль в развитии генной инженерии. Рестриктазы разрезают двойную спираль по специфическим последовательностям из 4-8 нуклеотидов. Они могут вносить тупой или ступенчатый разрез.

Под действием рестриктаз, вызывающих ступенчатые разрывы, на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные участки. Их называют “липкими концами”. Они способны к комплементарному взаимодействию с другим концом, образовавшимся под действием одного и того же фермента. Это используется для встраивания гена в вектор. Необходимо отметить, что способ получения гена из геномной ДНК, путем разрезания всей геномной ДНК с помощью рестриктаз приводит к тому, что клонируется огромное количество фрагментов. Это ведет к большому объему работы на этапе клонирования.

Ген может быть получен с помощью синтеза фрагмента ДНК с матричной РНК с использованием обратной транскриптазы. Такие фрагменты называют кДНК (комплементарными ДНК). Этот способ обладает следующими преимуществами: фракция мРНК, выделяемая из клеток представляет собой копии только активных – экспрессирующихся генов, в то время как геномная ДНК содержит большой объем неэкспрессируемых последовательностей. Кроме того, кДНК лишены интронов. Это может быть очень актуальным при клонировании эукариотических генов в прокариотических системах.

 

Вставка гена в вектор

Ген вводится в специальные молекулы ДНК, которые обеспечивают функционирование гена в новой генно-инженерной системе. Генетические элементы, используемые для создания рекомбинантной ДНК и введения ее в клетку, называют векторами. В качестве векторов чаще всего используют вирусы и плазмиды.

Плазмидные векторы созданы на основе природных бактериальных плазмид. Они представляют собой небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК. Такие векторы способны автономно реплицироваться благодаря наличию точки инициации репликации (ori). Плазмиды, которые используются в генной инженерии, содержат селективные маркеры. В качестве селективных маркеров часто используются гены устойчивости к антибиотикам. Обычно векторная молекула несет более одного селективного маркера. Благодаря таким маркерным генам на последующих этапах клетки, несущие рекомбинантную плазмиду, легко отделить от клеток, не имеющих такой рекДНК.

Вставка гена в вектор, т.е. создание рекДНК осуществляется стандартно с использованием рестриктаз. Векторная молекула, кроме ori и селективных маркеров должна нести уникальные сайты рестрикции для нескольких рестриктаз. Уникальный сайт рестрикции обеспечивает то, что при обработке соответствующей рестриктазой кольцевая молекула будет разрезана в одном строго определенном месте и превратится в линейную. При соединении клонируемого гена и вектора, обработанных одной и той же рестриктазой, эти молекулы могут соединяться в одно целое путем спаривания оснований «липких концов». Полученная молекула ДНК (вектор со встроенным геном) называется рекомбинантной (рекДНК). Соответственно, кодируемые рекомбинантными ДНК ферменты называют рекомбинантными ферментами, а клетки, экспрессирующие такие ферменты (или другие белки) – рекомбинантными клетками или рекомбинантными системами.

 

Трансформация клеток рекомбинантными ДНК

Рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК вводят в клетки (обычно бактериальные или дрожжевые), то есть трансформируют плазмидами. Для этого их делают временно проницаемыми для ДНК. Для повышения проницаемости клеток их обрабатывают ионами Ca²⁺ на холоду или обрабатывают электрическим током (процедура носит название электропорации). Если используется рекДНК, созданная на основе вирусного вектора, то процедура введения рекДНК в клетки носит название трансфекции.

После трансформации/трансфекции клеткам предоставляются оптимальные условия для размножения. Далее клетки высевают на плотную питательную среду для того, чтобы каждая клетка дала клон.

 

Отбор клонов

Все клетки одного клона генетически однородны и могут быть нескольких вариантов:

· не содержать рекДНК,

· содержать вектор без вставки гена;

· содержать рекДНК.

Для того, чтобы выявить клоны, содержащие рекДНК используется отбор на основе селективных маркеров. Так, когда в качестве селективных маркеров используется гены устойчивости к антибиотикам, клетки высевают на селективную питательную среду, содержащую соответствующий антибиотик. В таком случае расти будут только те клетки, которые имеют вектор с геном устойчивости. Чтобы выявить клетки, несущие не просто вектор, а рекДНК, используется отбор на основании второго маркера.

В случае клонирования фрагментов, полученных из геномной ДНК или кДНК получают набор клонов, несущих рекДНК с различными вставками – библиотеки геномной и кДНК. Для отбора клона с нужным геном из библиотеки используется гибридицация нуклеиновых кислот или анализ с помощью антител к белковому продукту клонированного гена.

 

Функционирование гена в клетке-реципиенте (адаптация гена)

Плазмида, попадающая в клетку-хозяин и придающая ей новые свойства является нестабильным образованием. Возможна ее деструкция под действием нуклеаз. Кроме того, на ее стабильность оказывает влияние динамика роста всей клеточной популяции. Выявляются определенные кинетические закономерности репликации плазмид. Число плазмид на клетку не является постоянным, а закономерно изменяется в процессе роста популяции. При этом все наблюдаемые случаи могут быть разделены на два типа – монофазные и двухфазные процессы (рис.5.1.1). В первом случае клетки временно теряют некоторое количество плазмид. Второй случай более сложен: уменьшение числа плазмид на начальном этапе в последующем сопровождается их гиперпродукцией.

Считается, что особенности кинетики репликации плазмид первого и второго типа обусловлены наличием периода индукции в случае плазмид второго типа.