Определение токсичности кормов, пораженных микроскопическими грибами.

 

Биологические методы. Биологические методы могут применяться как для определения санитарного качества пищевых продуктов, так и для определения токсигенной активности грибов. Учитывая различную чувствительность животных к микотоксинам, при биологических испытаниях чаще всего используют: цыплят, утят, кур, голубей, мышей, кроликов, некоторые виды рыб, растений, микроорганизмов, культур тканей. При этом используются различные методические приемы.

Метод скармливания. Токсичность кормов и продуктов питания можно определять методом скармливания. Для зерновых кормов используют мышей, голубей, утят 1-10 дневного возраста, цыплят 3-15дневного возраста. Для грубых и растительных кормов - морских свинок и кроликов. Для продуктов животного происхождения - кошек или собак

Суточная масса корма при биопробе заменяется исследуемым кормом на 50-100%. Испытуемые корма дают животным на протяжении 10 суток. Предварительно животных оставляют на 5-6 часов без корма, чтобы животные интенсивнее поедали испытуемые корма. Водопой не ограничивают. Ежедневно ведут учет съеденного животными корма. В зависимости от степени токсичности и количества съеденного корма признаки токсикоза могут проявиться в различное время. Корма с выраженной токсичностью вызывают гибель животных через 1 - 3 суток. Клиническая картина интоксикации, в большей или меньшей степени, характерна для каждого вида токсигенных грибов. Обычный срок наблюдении - до 15 суток.

Метод введения в желудок. Используют несколько вариантов этого способа.

При определении токсичности муки, крупы, некоторых продуктов животного происхождения делают водную взвесь (из расчета 1: 2 или 1: 3) и вводят в желудок через зонд в количестве 0,5 мл (на мышь). Введение повторяют три дня подряд.

Более распространен метод, в котором предусмотрено экстрагирование токсинов органическим растворителем - этанолом, ацетоном, эфиром, хлороформом и др. Затем растворитель удаляется на ротационном испарителе. Маслянистый остаток растворяют в подсолнечном масле (до 5 мл). Аликвотную часть масла вводят мышам в желудок с помощью зонда (до 1 мл). Один из вариантов этого способа является арбитражным и широко используются ветеринарными лабораториями. Предусмотрен­ный срок наблюдений - 3 суток. Если в течение этого срока погибает хотя бы одна мышь, то корм считается токсичным и выбраковывается. В случае отсутствия гибели животных производится вскрытие и учет патологоанатомических изменений внутренних органов. При наличии изменений в печени, почках, легких, сердце - корм считают малотоксичным. Рекомендуемый срок наблюдений не всегда достаточен для объективной оценки токсичности кормов и его целесообразно продлить до 5-7 суток.

Один из вариантов данного метода (при исследовании на афлатоксин) предусматривает использование для биопробы утят (как наиболее чувствительных). Экстракт (в виде суспензии на воде) после отгонки растворителя вводят утятам через зонд в желудок в количестве от 0,5 до 1,5 мл нарастающими дозами 3-4 раза (1 раз в сутки). Общий срок наблюдений - 7 суток. Зятем утят убивают и исследуют состояние печени. Наличие жировой дистрофии печени, множественных геморрагии, отечных явлений свидетельствуют о токсичности корма (характерные изменения для афлатоксикоза).

Кожная проба на кролике. Этот метод используется для определения токсичности различных видов кормов и продуктов питания.

При использовании данного метода 50 г измельченного продукта экстрагируют органическим растворителем (эфиром, хлороформом, смесью спирта с эфиром, ацетоном) в течение 24 часов. Затем экстракт отфильтровывают, а растворитель отгоняют. В остаток добавляют 1 мл подсолнечного масла и смесь тщательно растирают стеклянной палочкой. Для пробы подбирают здоровых кроликов (желательно светлой масти). Участок кожи (4-5 см) выбривают, наносят на него часть экстракта, втирая его палочкой. Через 24 часа наносят оставшуюся часть экстракта. Для предупреждения слизывания на шею кролика надевают фартук. Учет реакции проводят ежедневно на протяжении 7 суток. Обычно реакция развивается на второй день и постепенно усиливается к 4 дню. Есть данные, что кожа крупного рогатого скота, лошадей, овец, кур, гусей, собак и кошек также очень чувствительна к ядам. Кожа морских свинок обладает средней чувствительностью. Кожа белых мышей наименее чувствительна.

Степень токсичности определяется по характеру воспалительного процесса. При этом выделяют 4 степени токсичности.

Первая степень токсичности - покраснение, повышенная чувствительность кожи, шелушение. Симптомы, исчезающее через 1-2 дня после нанесения экстракта. Очень слабо токсичный корм.

Вторая степень - покраснение, болезненность, незначительное утолщение кожи, мелкие желтоватые пузырьки (редко). Затем на месте пузырьков образуются тонкие корочки подсохшего экссудата, наблюдается шелушение. Слабо токсичный корм.

Третья степень - сильное утолщение и складчатость кожи, болезненность, образование пузырьков на всей обработанной поверхности. Затем на месте обработанной поверхности развивается сухой некроз, иногда язвы. Токсичный корм.

Четвертая степень - покраснение, сильный отек, выступающий над поверхностью остальной кожи, глубокий сухой некроз, долго незаживающие язвы. Резко токсичный корм.

Контролем служит партия нетоксичного корма. Некоторые токсины (например, патулин) не оказывают резко выраженной дерматоксической реакции у кролика.

Внутрикожное введение в бородку кур. Используют эфирные или спиртовые экстракты, подготовленные по описанному выше способу. Маслянистый остаток или раствор остатка в подсолнечном масле вводят в одну из бородок кур В другую бородку вводят контрольный экстракт. Реакцию учитывают по наличию воспалительного процесса, отека, кровоизлияний и некроза на месте введения. Измеряют толщину бородки как показатель отека тканей.

Определение токсичности на простейших. Эта методика используется для первичного отбора токсинообразующих культур грибов, а также экстрактов из кормов. В качестве тест-объектов используют обычно один из двух видов Parameciumcaudatum, Tetrachymenapyriformis. Эти простейшие чувствительны ко многим ядам. Для испытания на токсичность 0,2 мл экстракта(или культуральной жидкости) вносят в лунку на предметном стекле и туда же вносят каплю культуры парамеций (с определенным их количеством). Капли перемешивают и ведут наблюдение под микроскопом за их активностью. В первый час наблюдение ведут каждые 2-3 минуты. Резко токсичные экстракты вызывают гибель парамеций через 8 минут, токсичные - через 20 минут слабо токсичным - через 2 часа. Нетоксичные экстракты гибели парамеций в течение 24 часов не вызывают.

Метод определения токсичности на рыбах гуппи. Данный метод предложен для определения токсичности зернофуража, пораженного микроскопическими грибами. Пробу зернофуража массой 50 г измельчают и экстрагируют 100 мл ацетона при периодическом встряхивании - 12 часов или на качалке - 2 часа, Сухой остаток растворяют в 5 мл чистого ацетона переносят в аквариум с водой (500 мл) при температуре 17-20°С, перемешивают и помещают в него 5 рыб гуппи. Отмечают время гибели рыб в течение 24 часов

 

Определение токсичности на эмбрионах птиц. Куриные эмбрионы используют для определения токсических свойств продуктов питания и кормов.вводят в желточный мешок 0,5 мл испытуемого экстракта. Затем отверстие заклеиваюти лоток с яйцами помещают в инкубатор (термостат).

Введение в воздушную пугу.

Для опыта отбирают 1-дневные эмбрионы. Перед работой яйца просматривают, карандашом отмечают границы воздушной пуги, делают отверстие в скорлупе над воздушным мешком и на мембрану яйца вводят 0,04 мл испытуемого раствора. Отверстие заклеивают. Эмбрионы помещают в термостат при 37°С и 52% относительной влажности.

Введение в хориоаллантоисную оболочку. 0,2 мл испытуемой жидкости вводят в хориоаллантоисную оболочку 3 дневного эмбриона через отверстие, которое делают надвоздушной пугой. Наблюдение за подопытными эмбрионами ведут 2 раза в сутки, в течение 21 суток. Биологическое воздействие токсина определяют по времени гибели эмбрионов и патологоанато-мическим изменениям.

Токсические экстракты кормов, зараженных грибами рода Fusarium, вызывают гибель эмбрионов через 18-25 часов, слаботоксичные - через 30-90 часов. Кровеносные сосуды на хориоаллантоисной оболочке при этом спавшиеся, зародыш гиперемирован (особенно головка и крылья), печень - мраморная, почки - кровенаполнены. На сердечной сорочке кровоизлияния.

При воздействии токсинов гриба рода As-pergillus на хориоаллантоисной оболочке отмечают гиперемию, кровоизлияния, внутренние органы дряблые.

Введение афлатоксинов в желток и воздушную пугу вызывает задержку роста и развития зародыша. Гибель эмбрионов наступает на 5-10 сутки. Если эмбрионы выживают дольше, то зародыш обычно не вылупливается. На вскрытии обнаруживают отек, кровоизлияния, недоразвитие мозга, дистрофические изменения в печени. Отмечается также недоразвитие клюва, укорочение ног, перьевой покров уплотнен.

Определение токсичности на культуре тканей. Доказана чувствительность к микотоксинам культуры клеток: печени куриных эмбрионов; печени, легких и почек крысят; почек теленка и обезьяны; печени эмбрионов человека; фибробластов кожи человека, клеток Хела и др.

Монослойные трипсипизированные

культуры клеток получают обычным способом.

Токсическое действие афлатоксинов на культуры клеток разных типов проявляется характерными морфологическими изменениями: разрушением клеточных органоидов, в том числе

лизосом, изменением ядерно-плазменного соотношения, снижением интенсивности митотическо-го деления, нарушением функциональной активности клеток. Установлено, что афлатоксин В в концентра­ции 0,05 мкг/мл полностью подавляет рост клеток легкого эмбриона человека. ЛД₅₀ для клеток Хела - от 5 до 7 мкг/мл, для клеток печени человека - 14,3 мкг/л.

Культуры клеток почечного эпителия теленка и перевиваемые клетки почек поросенка проявляют высокую чувствительность к токсинам грибов рода Fusarium. Даже в разведении 1-10"⁵ токсинов и экстрактов из зараженного зерна отмечалось изменение размера ядер и снижение активности митотического деления.

К токсинам грибов рода Aspergillusчувствительны клетки Хела, фибробласты эмбрионов человека.

Пеницилловая кислота в концентрации 10 мкг/мл стимулирует митотическую активность клеток Хела.

Патулин в дозах 0,5-1 мкг/мл вызывал увеличение числа патологических митозов на клетках Хел-2.

Определение токсичности на эритроцитах крыс. Исследованиями некоторых авторов было показано, что микотоксины вызывают гемолитическое действие при контакте с эритроцитами крыс. Доказано гемолитическое действие очищенных препаратов афлатоксина, охратоксина, зеараленона, Т-2 токсина.

Определение токсичности на микро­организмах.

Микробиологический метод основан на принципе непосредственного действия экстрактов на чувствительные к данному токсину бактериальные и дрожжевые клетки. О количестве токсина судят по зоне задержки роста тест-культуры. Чувстви­тельность метода - до 0,03 мкг/мл.

Для качественного определения обычно используют метод бумажных дисков, лунок, цилиндров, штрихов. Для количественного определения - метод серийных разведений.

Определение токсичности на растениях и водорослях. Большинство изученных в настоящее время микотоксинов: афлатоксин В,, патулин, пеницилловая кислота, рубратоксин, цитринин, трихотецены обладают выраженной фитотокси- ческой активностью.

Высокую чувствительность к дендродохину, фузариотоксину, стахиботриотоксину и др. проявляют проростки кукурузы, фасоли, кресс салата, пшеницы, овса и др.

Однако более удачным тест-объектомоказались водоросли Chlorellavulgaris. Метод широко апробирован при выделении патулина, роридина А, веррукарина А, пеницилловой кислоты, цитринина и др. Хлорелла, как тест-объект, обладает широким спектром чувствительности. Предложенные биологические методы обнаружения микотоксинов в кормах и продуктах питания с помощью этого метода по своей чувствительности соответствуют, а иногда и превышают необходимую чувствительность по МДУ.

Принято считать, что биологические методы обнаружения микотоксинов в кормах и продуктах питания более трудоемкие по сравнению с физико-химическими и более длительные. Однако, они являются обязательными для подтверждения наличия микотоксинов в исследуемых образцах.

Скрининг методы отличаются относи­тельной простотой и дают возможность быстро и надежно исключать отрицательные образцы. Наиболее перспективны в этом варианте методы мультидетекиии микотоксинов, т. е определения группы микотоксинов.

 

Количественное определение микотоксинов осуществляется обычно путем выявления интенсивности флуоресценции на пластинках в ультрафиолетовом свете, детекции способом жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектором или флуоресцентным детектором, масс-спектрометром. Для подтверждения наличия того или иного микотоксина на пластинках проводится их обработка различными химическими проявителями.