Работа № 1. Определение активности ЛДГ в сыворотке крови.

Принцип метода: основан на определении скорости снижения реакции катализируемой ЛДГ. Спектрофотометрическое определение оптической плотности при окислении НАДН₂ в НАД⁺ проводят при длине волны 340 нм (тест-Варбурга).

ПВК + НАД·Н + Н⁺ ← лактатдегидрогеназа → МК + НАД⁺

Скорость падения Е (оптической плотности) пропорциональна снижению концентрации НАДН и активности ЛДГ.

Ход работы: Настроить спектрофотометр на длину волны 340 нм. В чистую пробирку внести ниже перечисленные реактивы, затем перелить их в кювету спектрофотометра и через 30 секунд снимать показания прибора начиная с Ео через каждую минуту, в течение 3 минут.

Реактивы реакционной смеси:

1. Фосфатный буфер – 2,5 мл.

2. Сыворотка крови - 0,1 мл.

3. Р – р НАДН - 0,1 мл.

4. Р – р ПВК - 0,1 мл.

 

Расчет:

Из полученных в ходе измерений трех DЕс (экстинций), найти среднее значение (DЕ/мин.), которое умножить на коэффициент пересчета в международные единицы (U/л) – 8095.

U/л = 8095 х DЕ/мин.

Если полученный результат разделить на 16,67, то получим результат в нмоль/л.

В норме активность ЛДГ в сыворотке крови, замеренная при комнатной температуре, находится в пределах 120 – 240 U/л.

Работа № 2. Определение содержания молочной кислоты в сыворотке крови.

П ринцип метода: Определение молочной кислоты основано на реакции катализируемой ЛДГ (см. выше) и тесте-Варбурга – спектрофотометрической регистрации прироста НАДН при длине волны 340 нм, эквимолярному окисленной молочной кислоте.

Ход работы.

1.Этап. Получение безбелкового экстракта молочной кислоты.

В центрифужную пробирку отмерить 0,5 мл. крови (сыворотки) и 1 мл 0,6 М хлорной кислоты. Через 5 мин. инкубации осадить белки центрифугированием при 5 тыс.об/мин., в течение 5 минут. Полученную надосадочную жидкость слить в чистую пробирку и использовать для исследования в следующем этапе.

2.Этап. Запуск реакции и инкубирование.

Реакционную смесь приготовить исходя из таблицы:

Реагенты (мл).	Пробирки
Опыт	Контроль
Буферный раствор	2,0	2,0
Хлорный экстракт	0,2	-
Р – р НАД	0,1	0,1
Р – р хлорной кислоты	-	0,2

Инкубирование провести в термостате при 39 градусах, в течение 30 минут.

3.Этап. Спектрофотометрирование.

Содержимое пробирок опыта и контроля поочередно перелить в чистые кюветы и снять показания экстинций с прибора при длинне волны 340 нм., против воздуха.

4.Этап. Расчет: Еоп – Ек = DЕ

С ммоль/л = DЕ х 10535, где 10535 – коэффициент пересчета в ммоль/л.

В нормальной венозной сыворотке крови содержание молочной кислоты находится в пределах – 0,6 – 1,6 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение: Определение активности ЛДГ и содержания молочной кислоты в сыворотке крови широко используется в клинической практике для характеристики функционального состояния гликолиза, тканевого дыхания и проницаемости клеточных мембран. Так при снижении или полном прекращении поступления кислорода в ткани, при ингибировании или структурном повреждении ферментов тканевого дыхания происходит повышение обоих биохимических показателей. Однако при большинстве патологических состояний повышенная активность гликолиза и проницаемость мембран сочетаются и это приводит к более резкому увеличению концентрации МК и активности ЛДГ, например, при воспалительных процессах в почках, мышцах, ишемии тканей и т.д.

Существуют патологические состояния, когда наоборот, активность гликолиза снижается - при гипогликемических состояниях, дефиците регуляторных факторов, стимулирующих гликолиз или при его ингибировании.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 18. 10. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено доц. Трубачевым С.Д.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 10

(для студентов)

Факультеты: лечебно-профилактический, медико-профилактический, педиатрический

Курс: 2

1. Тема занятия: Пентозофосфатный шунт и глюконеогенез, регуляция обмена углеводов.

2. Учебная цель занятия: Знакомство с пентозофосфатным путем обмена моносахаридов, глюконеогенезом, уровнями и механизмами регуляции обмена углеводов.

3. Задачи занятия:

1. Получить представления о возрастных и тканевых особенностях функционирования реакций пентозофосфатного шунта и глюконеогенеза, об их интеграции с другими видами обмена, о номенклатуре и классификации ферментов катализирующих эти процессы и их коферментном составе, об уровнях и механизмах регуляции обмена углеводов.

2. Подробно разобрать регуляцию и написание ключевых реакции глюконеогенеза и окислительной стадии пентозофосфатного шунта.

3. Ознакомиться с распространенными ферментопатиями пентозофосфатного шунта, глюконеогенеза и обмена фруктозы.

4. Научиться самостоятельно выполнять исследование содержания глюкозы в сыворотке крови – ключевого диагностического показателя углеводного обмена.

4. Продолжительность занятия: 3 акад. часа.

5. Задание студентам:

1. Исследовать содержание глюкозы в сыворотке крови.

6. Методические указания к выполнению самостоятельной работы на занятии.

Практическая работа выполняется группами по 2 человека.

Работа № 1. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови.

Принцип метода: Глюкоза при нагревании с о-толуидином в растворе уксусной кислоты дает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию глюкозы.

Ход работы.

1. Центрифугирование.

В центрифужную пробирку внести 0,9 мл 3% р–ра ТХУ и по стенке 0,1 мл крови, смешать и центрифугировать при 5 тыс. об/мин., полученный супернатант слить в чистую пробирку.

2. Проведение цветной реакции.

В три чистые, маркированные пробирки внести реагенты, как указано в таблице.

	Пробирки
Опыт	Контроль	Стандарт
Супернатант	0,1	-	-
Физраствор	-	0,1	-
Р – р глюкозы	-	-	0,1
О-толуидин	4,5	4,5	4,5

Пробирки плотно закрыть крышками из фольги и поставить точно на 8 минут в кипящую водяную баню, по истечении этого времени осторожно остудить под струей холодной воды и использовать для колориметрического анализа. Если жидкость после нагревания мутна, ее необходимо вновь центрифугировать.

3. Колориметрирование окрашенных растворов провести при длине волны 600 – 650 нм - красном светофильтре в кюветах с ходом луча 10мм.

4. Расчет по формуле: Соп ммоль/л = Сст х Еоп/Ест,

где Сст = 5,5 ммоль/л

В нормальной капиллярной крови, взятой натощак, концентрация глюкозы находится в пределах: У детей 4,1 – 5,6 ммоль/л. У взрослых до 40 лет 3,3 – 5,5 ммоль/л. В 40 – 59 лет 4,1 – 5,9 ммоль/л. В 60 – 90 лет 4,4 – 6,4 ммоль/л. Концентрация глюкозы в сыворотке крови определяется выше примерно на 0,5 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение.

Концентрация глюкозы крови находится под контролем многих органов и систем и поэтому отражает их функциональное состояние, но в первую очередь функциональное состояние инсулярного аппарата и обмена инсулина, затем функциональное состояние эндокринных систем, вырабатывающих антиинсулярные гормоны и метаболизм этих гормонов. В меньшей степени уровень глюкозы отражает состояние внутренних органов прежде всего печени и почек, а также глюкозозависимых (головной мозг), интенсивно гликолизирующих тканей (опухолевая, жировая) и др. Вот почему при патологических состояниях указанных органов и систем исследуется концентрация глюкозы крови как диагностического и прогностического биохимического показателя, помогающего уточнить или установить диагноз, проследить динамику течения болезни и эффективность лечения, документировать выписку больного.

7. Контрольные вопросы по теме занятия (см. задание к занятию).

8. Литература для подготовки (см. задание к занятию).

9. Обсуждено на заседании кафедры 18. 04. 2010 г.

10. Учебное задание подготовлено доц. Трубачевым С.Д.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

кафедра биохимии

Утверждаю

Зав. каф. проф., д.м.н.

Мещанинов В.Н.

_____‘’_____________2010 г

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ