Определение содержания креатинина в биологических жидкостях

Задание 1. Определить содержание креатинина в сыворотке крови.

Принцип. Креатинин при взаимодействии с пикриновой кислотой в щелочной среде образует соединение оранжево-красного цвета, интенсивность которого определяют фотометрически.

Ход работы. Опытная проба - вносят 0,5 мл сыворотки крови, 1 мл дистиллированной воды и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты; калибровочная проба (эталонная) - вносят 0,5 мл калибровочного раствора (концентрация креатинина - 177 мкмоль/л), 1 мл дистиллированной воды и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Содержимое обеих пробирок перемешивают, оставляют стоять 5 мин, затем центрифугируют при 2500-3000 об/мин на протяжении 5 мин. Надосадочную жидкость сливают. В две центрифужные пробирки вносят по 1 мл надосадочной жидкости из каждой пробы, прибавляют по 0,5 мл пикриновой кислоты (0,04 моль/л) и 0,5 мл NaOH (0,75 моль/л). Перемешивают и точно через 20 мин фотометрируют в 1 см кювете при 505 нм против раствора сравнения. Раствор сравнения: в центрифужную пробирку вносят 1,5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты; перемешивают. Из этого раствора берут 1 мл и переносят в отдельную пробирку, прибавляют 0,5 мл пикриновой кислоты и 0,5 мл натрия гидроксида.

Концентрацию креатинина (Х) в мкмоль/л в сыворотке крови рассчитывают по формуле: Х=(Сэт.×Еоп.)/Еэт., где Сэт. - концентрация креатинина в эталонной пробе (177 мкмоль/л); Еоп. - оптическая плотность опытной пробы; Еэт. - оптическая плотность эталонной пробы. В норме содержание креатинина в сыворотке крови (натощак) составляет: для мужчин - 61-115 мкмоль/л, женщин - 53-97 мкмоль/л.

Внимание! При работе необходимо строго придерживаться правил работы с отравляющими веществами в химических лабораториях, так как пикриновая кислота - яд, а трихлоруксусная кислота и NaOH - едкие вещества!

Задание 2. Определить содержание креатинина в моче.

Принцип. Тот же.

Ход работы. Определение проводят в центрифужных пробирках, которые заполняют в соответствии со схемой:

	Опытная проба	Раствор сравнения
Моча разбавленная 1:100 (мл)	0,5	-
Вода дистиллированная (мл)	0,25	0,75
Трихлоруксусная кислота (мл)	0,25	0,25
Пикриновая кислота (мл)	0,5	0,5
NaOH (мл)	0,5	0,5

Перемешивают содержимое пробирок и точно через 20 мин измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной пробы против раствора сравнения в 1 см кювете при 505 нм. Эталонный (калибровочный) раствор готовят как и в случае определения креатинина в сыворотке крови. Количество креатинина (У) в ммоль/сут в моче рассчитывают по формуле:

У=(Сэт.×Еоп.×Д×50)/(Еэт.×1000), где Сэт. - концентрация креатинина в эталонной пробе (177 мкмоль/л); Еоп. - оптическая плотность опытной пробы; Еэт. - оптическая плотность эталонной пробы; Д - суточный диурез (1,5 л); 1000 - перевод мкмоль в ммоль; 50 - разведение мочи. В норме содержание креатинина в моче составляет: для мужчин - 8,8-17,7 ммоль/сут (1,0-2,0 г); женщин - 7,1-15,9 ммоль/сут (0,8-1,8 г).

Клинико-диагностическое значение. Концентрация креатинина в сыворотке крови здоровых людей относительно постоянная в результате строгой зависимости между его образованием и выделением. Креатинин относится к беспороговым веществам, он фильтруется только клубочками, но не реабсорбируется. Секреция креатинина канальцами возможна только при высокой концентрации его в крови. Определение креатинина для оценки клубочковой фильтрации обусловлено тем, что его концентрация в плазме обратно пропорциональна клиренсу при постоянных условиях выделения и концентрирования. Критической верхней границей установлена концентрация креатинина на уровне 115 мкмоль/л. Уровень креатинина в сыворотке повышается при ретенционных азотемиях. По нарастанию его концентрации в крови определяют степень хронической почечной недостаточности. Количество выделенного с мочой креатинина прямо зависит от содержания фосфокреатинина в мышцах. Количество креатинина в моче будет изменяться также и в зависимости от содержания креатинина в пище (его много в мясных продуктах). Повышенной экскрецией креатинина (гиперкреатинурия) сопровождаются лихорадочные состояния, острые инфекционные заболевания, сахарный и несахарный диабет. Креатинурия свидетельствует о патологии поперечно-полосатых мышц (мышечная дистрофия, атрофия, миастения). Гипокреатинурия наблюдается при заболеваниях почек, а именно - при хроническом нефрите, мышечной атрофии, после перенесенных инфекций, в преклонном возрасте и при алиментарной дистрофии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 250-261.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 303-314.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.–С.419-426, 429-430.

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 451-456, 459-468.

5. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 494-504, 515-517.

6. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 323-331.

7. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін./За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С.146-167.

ЗАНЯТИЕ 7

Тема: Функции и обмен нуклеотидов, его возможные нарушения. Определение мочевой кислоты в биологических жидкостях. Анализ конечных продуктов азотистого обмена. Определение общего азота в моче; азотистый баланс, его виды.

Актуальность. Нуклеотиды и их производные выполняют разнообразные функции в организме, принимая участие в синтезе нуклеиновых кислот и нуклеотидных коферментов, в реакциях депонирования и использования энергии, в образовании активных форм углеводов, азотистых оснований, сульфатов, метионина, в трансдукции сигналов в клетки и др. Синтез нуклеотидов имеет свои закономерности, в нём принимают участие разные метаболиты всех видов обмена веществ и специфические ферменты. Ферменты синтеза рибо- и дезоксирибонуклеотидов - мишень действия противовирусных и противоопухолевых препаратов. Конечным продуктом преобразования пуриновых нуклеотидов у человека является мочевая кислота, а пиримидиновых – СО₂, аммиак, мочевина, β-аланин, β-аминомасляная кислота. О состоянии обмена нуклеотидов судят по активности ферментов, которые принимают участие на разных стадиях их рас-пада и преобразования, а также по содержанию мочевой кислоты - конечного продукта пуринового обмена.

Цель. Рассмотреть структуру и роль в организме нуклеотидов, ознакомиться с процессом переваривания и всасывания нуклеопротеинов; синтезом и распадом пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Выучить основные механизмы регуляции обмена нуклеотидов и его нарушения: подагру, наследственную оротацидурию, синдром Леша-Нихана. Ознакомиться с методом количественного определения содержания мочевой кислоты в биологических жидкостях и его клинико-биохимическим значением. Подвести итог катаболизма простых и сложных белков (нуклеопротеинов); рассмотреть все конечные продукты азотистого обмена, азот которых составляет общий азот мочи; он отображает количество белка, который расщепился в тканях, и используется для изучения азотистого баланса организма.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Нуклеотиды, их структура и роль в организме.

2. Переваривание и всасывание нуклеопротеинов.

3. Образование 5'-фосфорибозил-1'-дифосфата в клетке; его участие в синтезе пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Роль фермента фосфорибозилдифосфатсинтетазы.

4. Синтез пиримидиновых нуклеотидов. Регуляция. Нарушение.

5. Синтез пуриновых нуклеотидов. Аминокислоты, которые принимают участие в синтезе пуринового скелета. Регуляция синтеза и возможные нарушения.

6. Синтез дезоксирибонуклеотидов.

7. Роль карбамоилфосфата в обмене белков и нуклеотидов.

8. Роль фермента гуанингипоксантинфосфорибозилтрансферазы в синтезе пуриновых нуклеотидов; его недостаточность.

9. Распад пиримидиновых нуклеотидов.

10. Распад пуриновых нуклеотидов.

11. Нарушение обмена пуриновых нуклеотидов. Гиперурикемия, её причины, биохимические механизмы коррекции.

12. Нарушение обмена пиримидиновых нуклеотидов. Оротацидурия.

13. Взаимосвязь между обменом белков и нуклеиновых кислот.

14. Конечные продукты катаболизма простых и сложных белков (нуклеопротеинов). Азотистый баланс, его виды.

 

31. К пуриновым основаниям относятся:

А. Аденин, гуанин. С. Цитозин.	Е. Все перечисленные.
В. Урацил, тимин. D. Псевдоуридин.

32. К пиримидиновым основаниям относятся:

А. Аденин. С. Урацил, тимин, цитозин.	Е. Все перечисленные.
В. Гуанин. D. Псевдоуридин.

33. Какое соединение является исходным в биосинтезе адениловой и гуаниловой кислот?

А. Инозиновая кислота. В. Гипоксантин.

С. Рибозо-5-фосфат. D. Карбамоилфосфат.

Е. 1-дифосфат.

34. Какое соединение является источником аминогрупп при биосинтезе адениловой кислоты из инозиновой кислоты?

А.Аспартат. В.Глутамин. С.Глицин. D.Аспарагин. Е. Карбамоилфосфат.

35. У больного боль в мелких суставах, суставы увеличены. В сыворотке крови повышен уровень уратов. Обмен каких веществ нарушен?

А. Аминокислот. В. Дисахаридов.

С. Пуринов. D. Пиримидинов.

Е. Глицерина.

36. У мальчика с наследственным синдромом Леша-Нихана проявляются симптомы подагры и нервно-психические изменения. Нарушение какого метаболического пути предопределяет развитие этих симптомов?

А. Синтеза пуриновых нуклеотидов из свободных оснований.

В. Синтеза пуриновых оснований из аминокислот.

С. Синтеза пиримидиновых оснований из аминокислот.

D. Распада пуриновых оснований.

Е. Распада пиримидиновых оснований.

37. Назовите минорное соединение, которое принимает участие в образовании «кэпа» в мРНК.

А. 7-метилгуанозин.	D. 7-метиладенозин.
В. 1-метиладенозин. С. 5-оротоуридин.	Е. Метилцитозин

38. К биологическим функциям ДНК относятся:

А. Хранение наследственной информации.	D. Хранение и передача информации.
В. Передача генетической информации потомкам. С. Реализация генетической информации.	Е. Все перечисленное.

39. Синтез праймера - фрагмента РНК - происходит на стадии:

А. Инициации. В. Элонгации. С. Терминации. D. Репликации. Е. Трансляции.

40.Аминокислота в ходе синтеза амино-ацил-тРНК присоединяется к:

А. Антикодону.	С. 3`-Концу тРНК.	Е. 3`-концу мРНК.
В. Кодону.	D. 5`-Концу тРНК.

41.Антибиотик рифамицин, который используют для лечения туберкулеза, влияет на некоторые биохимические процессы. Назовите их.

А. Ингибирует ДНК-полимеразу на стадии инициации.

В. Ингибирует РНК-полимеразу на стадии инициации.

С. Ингибирует ДНК-лигазу.

D. Ингибирует аминоацил-тРНК-синтетазу.

Е. Ингибирует действие белковых факторов в синтезе белка.

 

31. У ребенка наблюдается задержка роста и психического развития, с мочой выделяется большое количество оротовой кислоты. Эта болезнь наблюдается в результате нарушения:

А. Синтеза пиримидиновых нуклеотидов.

В. Распада пиримидиновых нуклеотидов.

С. Синтеза пуриновых нуклеотидов.

D. Распада пуриновых нуклеотидов.

Е. Преобразования рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды.

32. У мальчика, 5 лет, с признаками детского церебрального паралича лабораторно выявлена повышенная концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови. Поставлен диагноз - синдром Леша-Нихана. Генетический дефект какого фермента является причиной возникновения этой патологии?

А. УДФ-глюкуронилтрансферазы. В. УДФ-гликозилтрансферазы. С. Гиалуронидазы.

D. Лактатдегидрогеназы. Е. Гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы.

33. Производные птерина - аминоптерин и метатрексат - являются конкурентными ингибиторами дигидрофолатредуктазы, вследствие чего они угнетают образование тетрагидрофолиевой кислоты из дигидрофолиевой. Эти препараты приводят к угнетению межмолекулярного транспорта одноуглеродных групп. Биосинтез какого нуклеотида при этом угнетается?

А. ИМФ. В. УМФ. С. АМФ. D. Карбамоилфосфат. Е. дТМФ.

34. Ребенок, 3 года, страдает умственной отсталостью и тяжелой формой мегалобластической анемии, которая является стойкой к лечению витаминами В₉ и В₁₂. В моче выявлена оротовая кислота. Нарушением синтеза каких веществ обусловлена мегалобластическая анемия?

А. АМФ, ГМФ. В. ЦТФ. С. АТФ. D. ГТФ. Е. УМФ.

35. У больной увеличены суставы. В крови – повышено содержание уратов. Назовите патологию?

А. Рахит. В. Скорбут. С. Пеллагра. D. Кариес. Е. Подагра.

36. Какой биохимический анализ следует провести для уточнения диагноза - подагра?

А. Определение содержания аминокислот в крови.

В. Определение концентрации мочевины в крови и моче.

С. Определение содержания креатина в крови.

D. Определение активности уриказы в крови.

Е. Определение уровня мочевой кислоты в крови и моче.

37. У больных пигментной ксеродермой кожа очень чувствительна к солнечному свету, может развиться рак кожи. Причина - наследственная недостаточность фермента УФ-эндонуклеазы. Вследствие какого дефекта нарушается процесс?

А. Репликации ДНК.	С. Репарации ДНК.	Е. Обратной транскрипции.
В. Транскрипции.	D. Трансляции.

38. В клинической практике нашли широкое использование антибиотики, которые являются ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот и белка. Какую реакцию или процесс тормозит тетрациклин?

А. Элонгацию полипептидной цепи у прокариот и эукариот.

В. Инициацию трансляции у прокариот.

С. Связывание аминоацил-тРНК в А-центре рибосом прокариот.

D. Инициацию транскрипции у прокариот.

Е. Пептидилтрансферазную реакцию процесса трансляции у прокариот.

39. Удаление из цепи ДНК измененного азотистого основания достигается согласованным действием всех перечисленных ниже ферментов, кроме:

А. РНК-зависимой-ДНК-полимеразы.	D. Эндонуклеазы.
В. ДНК-полимеразы. С. ДНК-гликозидазы.	Е. ДНК-лигазы.

40. Больному с рожистым воспалением врач назначил эритромицин, который связывается с 50S-субъединицей рибосом и блокирует транслоказу. Ингибирование синтеза белка у прокариот эритромицином происходит на стадии:

А. Терминации. В. Активации аминокислот. С. Элонгации.

D. Посттрансляционной модификации белков. Е. Инициации.

41. Работница химического предприятия вследствие нарушения правил безопасности работы подверглась действию азотистой кислоты и нитритов, которые вызывают дезаминирование цитозина в молекуле ДНК. Какой фермент запускает цепь репарационных процессов?

А. ЦТФ-синтетаза. В. ДНК-зависимая-РНК-полимераза.	D. Аминоацил-тРНК-синтетаза. Э. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.
С. Урацил-ДНК-гликозидаза.

 

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА