По методу Н. В. Климинкиной и С. И. Плитмана

Задание 1. Провести количественное определение гистамина в крови.

Принцип. Метод базируется на взаимодействии гистамина с диазотованным п -нитроанилином с образованием соединений оранжево-красного цвета.

Ход работы. Кровь, из которой предварительно осадили белки 10% раствором трихлоруксусной кислоты, для экстракции гистамина выдерживают в холодильнике на протяжении суток, фильтруют через бумажный фильтр. В одну пробирку отмеривают 2 мл фильтрата (опыт), в другую – 0,2 мл стандартного 200 мкмоль/л раствора гистамина и 1,8 мл воды (стандарт). В обе пробирки прибавляют по 3 мл воды и 1 мл 4% натрия нитрата. Пробирки тщательно встряхивают и кипятят на водяной бане 2 мин, затем охлаждают под струей водопроводной воды и прибавляют по 1 мл диазотованного п -нитроанилина (готовят перед применением из 0,1% раствора п- нитроанилина в 0,1 моль/л растворе хлоридной кислоты, прибавляя к 10 мл охлажденного раствора 1 мл 4% натрия нитрата). Тщательно перемешивают пробы и доводят их рН до 10,0 по универсальной бумаге, прибавляя 1,5 мл, а затем 0,5 мл 20% натрия карбоната. Содержимое пробирок перемешивают, охлаждают под струей водопроводной воды и прибавляют 2-3 капли 20% натрия гидроксида до появления окраски. Экстинкцию опытной и стандартной проб измеряют на ФЭК при длине волны 520-540 нм (зеленый светофильтр) в 5 мм кювете против контроля (10 мл воды, по 2 мл растворов натрия нитрата и диазотованного п -нитроанилина, 4 мл раствора натрия карбоната), перемешивают и прибавляют 0,6 мл раствора натрия гидроксида. Содержание гистамина (Х) в мкмоль/л рассчитывают по формуле:

Х = (Еоп.×200)/Ест., где Еоп. - экстинкция опытной пробы; Ест. - экстинкция стандартной пробы; 200 - концентрация стандартного раствора гистамина, мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение. Гистамин - биологически активное вещество, которое принимает участие в регуляции жизненных функций организма. Вызывает расширение сосудов на месте воспаления и тем самым ускоряет поступление лейкоцитов, приводящих к активации защитных сил организма; имеет непосредственное отношение к развитию аллергических и иммунных реакций, процессов сенсибилизации и десенсибилизации; выполняет роль медиатора боли. При обычных условиях гистамин находится преимущественно в неактивном (связанном) состоянии. В крови здорового человека его концентрация составляет 0,02-0,04 мкмоль/л. При некоторых патологических процессах (анафилактический шок, ожоги, сенная лихорадка и другие аллергические заболевания), а также при поступлении в организм химических веществ, в том числе лекарственных препаратов, количество свободного гистамина увеличивается. Гистамин вызывает спазм гладкой мускулатуры, расширение сосудов и снижение артериального давления; в связи с застоем крови в капиллярах и увеличением проницаемости их стенок имеет место отёк окружающих тканей и сгущение крови.

В клинико-биохимических лабораториях определение содержания некоторых биогенных аминов имеет диагностическое значение. При тяжелом нефросклерозе повышается содержание в плазме крови тирамина, в случае шока - серотонина, при аллергических заболеваниях - гистамина.

ЛІТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 234-235, 240-242.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 286-295.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія люди-ни: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 406-407, 412-413.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 332-333, 337-339.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 431, 440-446.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 512-520.

7. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін./За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С.146-167.

8. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 196-202.

ЗАНЯТИЕ 3

Тема: Дезаминирование и трансаминирование аминокислот. Определение активности трансаминаз в сыворотке крови.

Актуальность. Дезаминирование - это отщепление аминогруппы от аминокислот с обязательным образованием аммиака. Доказано существование четырех типов дезаминирования аминокислот: восстановительного, гидролитического, внутримолекулярного и окислительного. Реакция трансаминирования заключается в межмолекулярном переносе аминогруппы от аминокислоты на α-кетокислоту без промежуточного образования аммиака. В процессе реакции образуются новые амино- и α-кетокислоты. Реакции трансаминирования являются обратимыми и универсальными для всех живых организмов, катализируются ферментами аминотрансферазами (трансаминазами). Трансаминирование имеет большое значение для синтеза заменимых аминокислот и трансдезаминирования большинства аминокислот. Изучение реакций дезаминирования и трансаминирования позволит будущим врачам рационально использовать знания об обмене белков и аминокислот для анализа многочисленных его нарушений.

Цель. Выучить реакции дезаминирования и трансаминирования аминокислот в организме, их значение и механизм действия ферментов. Ознакомиться с методом определения активности аспартат- (АсАТ) и аланинаминотрансфераз (АлАТ) в сыворотке крови и его клинико-диагностическим значением.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Основные пути дезаминирования аминокислот в организме.

2. Прямое и непрямое дезаминирование L-аминокислот. Механизм действия и роль оксидаз и глутаматдегидрогеназы. Клиническое значение определения активности глутаматдегидрогеназы в крови.

3. Дезаминирование аминокислот серина, треонина, цистеина та гастидина.

4. Трансаминирование, его роль в обмене аминокислот. Механизм действия аминотрансфераз. Роль витамина В₆. Клиническое значение определения аминотрансфераз в крови.

5. Реакция трансаминирования между α-кетоглутаровой и аспарагиновой кислотами. Её значение. Исследование в клинике АсАТ.

6. Реакция трансаминирования между α-кетоглутаровой кислотой и аланином. Её значение. Исследование в клинике АлАТ.

7. Реакция восстановительного аминирования α-кетоглутаровой кислоты, её роль.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Какой фермент осуществляет дезаминирование глутамата?

А. Глутаматдегидрогеназа.	D. Глутаминаза.
В. γ-Глутамилтрансфераза.	Е. Цистатионин-γ-лиаза.
С. Глутаматдекарбоксилаза.

2. Укажите, какая патология наиболее вероятна при увеличении в сыворотке крови активности аспартатаминотрансферазы?

А. Хронический гепатит.	D. Сахарный диабет.
В. Почечная недостаточность.	Е. Инфаркт миокарда.
С. Несахарный диабет.

3. Укажите класс ферментов, к которому относится глутаматдегидрогеназа.

А.Трансферазы. В.Изомеразы. С. Лиазы. D. Оксидоредуктазы. Е. Лигазы.

4. Для диагностики некоторых заболеваний определяют активность трансаминаз в крови. Какой витамин входит в состав кофакторов этих ферментов?

А. В₆. В. В₂. С. В₁. D. В₃. Е. В₁₂.

5. Какое соединение является акцептором аминогрупп в реакциях трансаминирования аминокислот?

А. Аргининосукцинат. С. Лактат.	Е. Орнитин.
В. α-Кетоглутарат. D. Цитруллин.

6. По клиническим показателям пациенту назначен пиридоксальфосфат. Для коррекции каких процессов используется этот препарат?

А. Синтеза пуриновых и пиримидиновых оснований.

В. Окислительного декарбоксилирования α -кетокислот.

С. Дезаминирования аминокислот.

D. Трансаминирования и декарбоксилирования аминокислот.

Е. Синтеза белка.

7. При гепатите, инфаркте миокарда в плазме крови больных резко увеличивается активность трансаминаз. Назовите возможную причину.

А. Повышение активности ферментов гормонами.

В. Повреждение мембран клеток и выход ферментов в кровь.

С. Недостаточность пиридоксина.

D. Увеличение скорости синтеза аминокислот в тканях.

Е. Увеличение скорости распада аминокислот в тканях.

8. Какая аминокислота подвергается наиболее интенсивно окислительному дезаминированию:

А. Лейцин. В. Валин. С. Глутамат. D. Серин. Е. Аспартат.

9. Какие продукты образуются при трансаминировании между α-кетоглутаратом и аланином?

А. Аспартат и лактат.	С. Глутамат и пируват.
В. Глутамат и лактат.	D. Глутамин и аспарагин.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА