Определение содержания мочевой кислоты

В биологических жидкостях по методу Мюллера и Зейферта.

Определение общего азота в моче по методу Кьельдаля.

Задание 1. Определить содержание мочевой кислоты в сыворотке крови.

Принцип. Метод базируется на способности мочевой кислоты восстанавливать фосфатно-вольфраматный реактив (реактив Фолина) с образованием соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации этой кислоты.

Ход работы. В центрифужную пробирку вносят по 1,5 мл сыворотки крови, воды и 20% раствора ТХУ. Перемешивают, через 5 мин центрифугируют 10 мин при скорости 3000 об/мин. Берут две чистые градуированные пробирки (опытную и стандартную), прибавляют в них реактивы в соответствии со схемой.

	Опыт	Стандарт
Центрифугат (0,5 мл сыворотки)	1,5 мл	-
Стандартный раствор мочевой кислоты, 0,2 мг/мл	-	0,5 мл
20% Трихлоруксусная кислота	-	0,5 мл
Дистиллированная вода	-	0,5 мл
Насыщенный раствор натрия карбоната	0,7 мл	0,7 мл
Реактив Фолина (осторожно!)	1 капля	1 капля

Через 10 мин обе пробы фотометрируют против воды на ФЭК при длине волны 510-560 нм (зеленый светофильтр) в 5 мм кювете. Содержание мочевой кислоты (Х) в ммоль/л в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

Х = (Еоп.×0,01×200)/(Ест.×168), где Еоп. - экстинкция опытной пробы; Ест. - экстинкция стандартной пробы; 0,01 - масса мочевой кислоты в пробе стандартного раствора, взятого для реакции (мг); 200 - коэффициент пересчёта на 1 л сыворотки крови; 168 - молекулярная масса мочевой кислоты.

Задание 2. Определить содержание мочевой кислоты в моче.

Принцип. Метод базируется на способности мочевой кислоты восстанавливать фосфатно-вольфраматный реактив (реактив Фолина) в фосфатно-вольфрамовую синь, интенсивность окраски которой пропорциональна концентрации мочевой кислоты. Количество фосфатно-вольфрамовой си-ни определяют титрованием раствором калия гексацианоферрата (III). Последний окисляет фосфатно-вольфрамовую синь, окраска которой исчезает.

Ход работы. К 1,5 мл мочи прибавляют 1 мл 20% раствора натрия карбоната и 1 мл реактива Фолина, перемешивают и титруют раствором 0,01 моль/л калия гексацианоферрата (III) до исчезновения синего окрашивания. Для расчета содержания мочевой кислоты в моче необходимо знать, какое её количество соответствует 1 мл раствора 0,01 моль/л калия гексацианоферрата (III). Так, если на титрование 1,5 мл стандартного раствора мочевой кислоты, которая содержит 0,75 мг этой кислоты, после добавления 1 мл 20% раствора натрия карбоната и 1 мл реактива Фолина израсходовано 0,81 мл калия гексацианоферрата (III), тогда его 1 мл отвечает: 0,75/0,81=0,8 г мочевой кислоты. Содержание мочевой кислоты (В) в мг/сут в моче рассчитывают по формуле: В = (0,8×а×в)/1,5, где 0,8 г мочевой кислоты отвечает 1 мл калия гексацианоферрата (III); а - количество калия гексацианоферрата (III), израсходованное на титрование (мл); в - суточный диурез; 1,5 - количество мочи, взятой для определения (мл). Коэффициент перерасчета в единицы СИ (ммоль/сут) составляет 0,0059.

Клинико-диагностическое значение. Мочевая кислота является конечным продуктом обмена пуриновых нуклеотидов. В норме концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови составляет 0,10-0,40 ммоль/л, а с мочой выделяется 2,36-5,90 ммоль/сут. Повышенное содержание мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) имеет место при многих патологических состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеинов (лейкозы, диабет, аллергии), при дефектах ферментов фосфорибозилдифосфатсинтетазы и гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (подагра, синдром Леша-Нихана), аденинфосфорибозил-трансферазы (мочекаменная болезнь), а также при болезни Гирке (недостаточность глюкозо-6-фосфатазы в печени). Увеличение концентрации мочевой кислоты является главным диагностическим критерием подагры. Очевидно, что при смещении реакции среды в кислую сторону, мочевая кислота откладывается в тканях, хрящах, суставных сумках. Гипоурикемия и повышенная экскреция гипоксантина и ксантина могут быть следствием недостаточности ксантиноксидазы, вызванной нарушениями в структуре гена этого фермента, или результатом повреждения печени. Гипоурикурия отмечается при подагре, нефрите, почечной недостаточности; гиперурикурия может наблюдаться при повышенном поступлении и усиленном распаде нуклеопротеинов. У детей выделяется относительно больше мочевой кислоты, чем у взрослых.

Задание 3. Определить общий азот мочи по методу Кьельдаля.

Принцип. Мочу сжигают (минерализуют) в концентрированной сульфатной кислоте. При этом азот всех органических и неорганических соединений в виде аммиака связывается с сульфатной кислотой, переходит в аммоний сульфат, который, реагируя с реактивом Несслера, образует соединение желто-оранжевого цвета. Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации азота.

Ход работы. 1. Минерализация. В пробирку наливают 0,5 мл мочи, прибавляют 0,05 мл конц. сульфатной кислоты. Сжигание осуществляют на песчаной бане: пробирка должна касаться только верхнего пласта песка. Сначала испаряется вода, моча приобретает бурую окраску. Пробирку снимают с бани, дают ей остыть, прибавляют 2 капли пергидроля и снова ставят для сжигания до обесцвечивания жидкости. Следует проверить цвет жидкости в пробирке после её охлаждения, поскольку часто жидкость, которая кажется бесцветной в горячем состоянии, во время охлаждения темнеет. После охлаждения в пробирку прибавляют 10 мл кипячёной дистиллированной воды, нейтрализуют 12,5 М едким натром до слабо щелочной реакции, которую определяют по изменению цвета лакмусовой бумажки с красного на синий. Излишек основания в случае нейтрализации приводит к помутнению раствора. Недостаточность основания вызывает выпадение солей ртути из реактива Несслера, и опыт считают испорченным.

2. Цветная реакция (несслеризация). В пробирку прибавляют 0,5 мл реактива Несслера, вследствие чего содержимое пробирки окрашивается в жёлтый цвет разной интенсивности в зависимости от содержания азота. Параллельно с опытной пробой обрабатывают стандартную: 0,2 мл стандартного раствора аммония сульфата; 0,05 мл конц. сульфатной кислоты; 0,3 мл 12,5 М раствора едкого натра; 0,5 мл реактива Несслера и 9,8 мл дистиллированной воды. Опытную и стандартную пробы измеряют против контроля при длине волны 440-450 нм в 5 мм кювете. Контроль готовят так же, как и стандартную пробу, но вместо стандартного раствора аммония сульфата прибавляют воду. Контрольная проба должна иметь лёгкий желтоватый оттенок. Более насыщенный цвет контроля свидетельствует о наличии в дистиллированной воде азота (аммиака). Расчет осуществляют по формуле: Соп.=Сст.∙ (Еоп./Ест.), где Соп. - концентрация общего азота в моче (ммоль/л); Еоп. - экстинкция опытной пробы; Сст. - концентрация общего азота в стандарте; Ест - экстинкция стандартной пробы.

Клинико-диагностическое значение. В сутки человек выделяет 10-17 г азота, из которого 80-90% приходится на мочевину. По этому показателю определяют азотистый баланс организма, а также функциональное состояние печени, почек и других органов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 270-283.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 329-343.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 435-462.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 351-355.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 469-477, 498-503.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 521-544.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 339-350.

8. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін./За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С.180-189.

9. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 212-219.

ЗАНЯТИЕ 8

Тема: Биосинтез нуклеиновых кислот и белков (матричные биосинтезы). Перенос генетической информации. Основы молекулярной генетики.

Актуальность. Одним из главных достижений современной биохимии и её новейших разделов является расшифровка механизмов биосинтеза нуклеиновых кислот и белка. Аминокислоты располагаются в полипептидной цепи не хаотично, а в точно определенной последовательности, которая обеспечивает уникальность структуры и функций. Механизм биосинтеза белков должен иметь точную координирующую систему, которая автоматически программирует включение каждого аминокислотного остатка в определенное место полипептидной цепи. Координирующая система определяет первичную структуру, а вторичная и третичная структуры белковой молекулы определяются первичной, её физико-химическими свойствами и химическим строением. Функции сохранения, реализации и передачи наследственной информации выполняют нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК). ДНК выполняет функцию носителя генетической информации, передача которой происходит с помощью более лабильных, чем ДНК, структур - РНК. Единственными веществами, в которых реализуется генетическая информация, являются белковые макромолекулы. Процесс переноса генетической информации определяет развитие и деятельность живого организма. Специализация функций клеток (печени, мозга, мышц и т.п.) зависит от набора белков и, в первую очередь, ферментов, которые контролируют обменные процессы на клеточном уровне.

Цель. Детально выучить матричные биосинтезы с целью использования полученных знаний для понимания механизмов регуляции активности генов у прокариотов и эукариотов, действия ингибиторов матричных биосинтезов - лекарственных препаратов и бактериальных токсинов, молекулярных механизмов генетической изменчивости, молекулярной патологии биосинтеза белков, принципов лечения и профилактики молекулярных заболеваний, использование рекомбинантных ДНК и клонирование генов в медицине.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Репликация ДНК; биологическое значение; полуконсервативный механизм репликации. Открытие Дж. Уотсона и Фр. Крика.

2. Общая схема биосинтеза цепей ДНК. Ферменты репликации ДНК у прокариот и эукариот: схема репликации ДНК.

3. Молекулярные механизмы репликации ДНК: значение антипараллельности цепей ДНК: фрагменты Оказаки. Этапы синтеза дочерних цепей молекул ДНК.

4. Общая схема транскрипции РНК. РНК-полимеразы прокариот и эукариот.

5. Этапы и ферменты синтеза РНК. Сигналы транскрипции: промоторные, инициирующие, терминаторные участка генома.

6. Процессинг - посттранскрипционная модификация РНК. Антибиотики - ингибиторы транскрипции.

7. Генетический (биологический) код, триплетная структура, свойства.

8. Рибосомальная белоксинтезирующая система, её компоненты. Структура рибосом эукариот.

9. Транспортные РНК и активация аминокислот. Аминоацил-тРНК-синтетазы.

10. Этапы и механизмы трансляции: инициация, элонгация, терминация. Инициирующие и терминирующие кодоны мРНК; роль белковых факторов рибосом в трансляции.

11. Посттрансляционная модификация пептидных цепей. Регуляция трансляции. Молекулярные механизмы контроля трансляции на примере биосинтеза глобина.

12. Влияние физиологически активных веществ на процессы трансляции. Антибиотики - ингибиторы трансляции у прокариотов и эукариотов, их использование в медицине.

13. Регуляция экспрессии генов прокариотов. Схема по Ф.Жакобу и Ж.Моно: структурные и контрольные гены: промотор, регуляторный ген.

14. Особенности молекулярной организации ДНК и экспрессия генома эукариот (экзоны, интроны; повторяющиеся последовательности).

15. Генетические рекомбинации у прокариот (трансформация, трансдукция, конъюгация).

16. Биологическое значение и механизмы репарации ДНК. Репарация УФ-индуцированных генных мутаций; пигментная ксеродерма.

17. Генная инженерия или технология рекомбинантных ДНК: общие понятия, биомедицинское значение.

18. Технология трансплантации генов и получение гибридных молекул ДНК. Клонирование генов с целью получения биотехнологических лекарственных веществ (гормонов, ферментов, антибиотиков, интерферонов и т.п.).

19. Мутации: геномные, хромосомные, генные. Роль в возникновении энзимопатий и наследственных болезней человека.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

11. У юноши, 20 лет, с помощью полимеразной реакции поставлен диагноз ВИЧ-инфекция. Укажите, что является основным в этой реакции.

А. Генетическая рекомбинация. В. Амплификация генов.	D. Генная мутация. Е. Хромосомная мутация.
С. Транскрипция.

12. Для уточнения диагноза врач рекомендовал больному ДНК-диагностику. Известно, что при этом используют синтетические праймеры, в состав которых входят:

А. Дезоксирибонуклеотиды. В. Рибонуклеотиды.	D. Пиримидиновые нуклеотиды. Е. Пуриновые нуклеотиды.
С. Аминокислоты.

13. Взаимодействие тРНК с аминокислотами с образованием аминоацил-тРНК нуждается в: А. НАД. В. ФАД. С. АТФ. D. АМФ. Е. Витамин В₁.

14. Репликация одной молекулы ДНК у прокариот осуществляется из:

А. Одной репликативной вилки В. Нескольких репликативных вилок.

С. Нескольких тысяч репликативных вилок.

D. Нескольких сот репликативных вилок.

Е. Нескольких десятков репликативных вилок.

15. Участки ДНК, которые несут информацию о структуре белка, называют:

А. Интроны. В. Экзоны. С. Гистоны. D. Опероны. Е. Кодоны.

16. Аномальный гемоглобин М появился в результате замены в β-цепи глобина аминокислоты валина на глутамат в 67 положении. Какой тип мутация в ДНК?

А. Миссенс-мутация. В. Делеция одного нуклеотида.	D. Делеция трёх нуклеотидов. Е. Вставка трёх нуклеотидов.
С. Вставка одного нуклеотида.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 284-329.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 344-393.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 463-506.

4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 356-425.

5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 478-498, 509-544.

6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 140-226.

7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 92-159.

ЗАНЯТИЕ 9