Оценка спермы по густоте и активности

Густоту определяют под микроскопом. Косвенный показатель концентрации спермы (ошибка 30%). Определяют только в свежеполученной сперме.

Методика определения:

Используют предметное стекло, его кладут на электрообогревательный столик, на стекло наносят каплю неразбавленной спермы, накрывают покровным. Микроскопируют (при увеличении в 30 раз, слегка опущенном конденсоре, полуоткрытой диафрагме).

В зависимости от количества половых клеток в эякуляте сперма бывает 3х видов: густая, средняя, редкая.

Густая сперма (Г) – все поле зрения микроскопа заполнено сперматозоидами без промежутков между ними. Наблюдается вихреобразное движение разных потоков половых клеток. Обычно такая сперма у баранов, реже у быков.

Средняя сперма (С) – когда расстояние между сперматозоидами в среднем меньше длины спермиев.

Редкая сперма (Р) – половые клетки располагаются на значительном расстоянии друг от друга (более их длины).

Показатели густоты у разных видов животных:

Животное	Количество спермиев (млрд/мл)
Бык	Густая 1+, средняя 0,6-1, редкая менее 0,6
Баран	Густая 2+, средняя 1-2, редкая менее 1
Хряк	Густая 0,2+, средняя 0,1-0,2, редкая менее 0,1
Жеребец	Густая 0,25+, средняя 0,15-0,25, редкая менее 0,15

К дальнейшему исследованию и использованию допускается сперма с оценкой Г (у баранов, как исключение средняя), Г или С (у быка, хряка, кобеля).

Отклонения от нормы:

· Аспермия (А), отсутствие спермиев;

· Олигоспермия (О) единичные сперматозоиды в поле зрения(10-20);

· Некроспермия (Н) неподвижные, мертвые спермии;

· Единичные спермии (Е) менее 10 половых клеток в поле зрения при малом увеличении.

· Тератоспермия (Т) повышенное содержание в эякуляте патологических форм спермиев.

Активность спермиев (подвижность) – способность к прямолинейно-поступательному движению. Определяют активность всегда (и после получения, и после хранения).

Различают 3 вида движения половых клеток:

1) Прямолинейно-поступательное движение (только такое движение гарантирует оплодотворение у наземных млекопитающих) - ППД;

2) Манежное движение (нормальный вид движения для оплодотворения икринок водноживущих, является переходным от нормального к некроспермии у наземных млекопитающих) - М;

3) Колебательное движение (конвульсивное вздрагивание половых клеток на одном месте) – К.

Методика исследования

Предметное стекло нагревают на электрообогревательном столике, наносят каплю спермы, рядом с ней (но не смешивая) одну каплю цитрата натрия концентрацией 2,9% (изотоничный раствор) (для свежеполученной спермы). Сверху накрывают покровным стеклом, капли смешиваются, после чего находят границу слияния капель. При этом находят поле зрения с небольшим количеством клеток. Определяют процент спермиев с прямолинейно-поступательным движением. Активность определяют по десятибалльной системе, 1 балл приравнивают к 10% спермиев с прямолинейно-поступательным движением.

Для дальнейшего разбавления и хранения допускают сперму у быка и хряка Г и С, не менее 8 баллов, у барана Г и С 9-10 баллов, у жеребца Г и С не менее 6 баллов.

Энергетика спермиев

Химические процессы: дыхание, гликолиз, распад АТФ

В теле, хвостике, иногда в шейке.

Дыхание спермиев

Питательное вещество соединяется с кислородом (глюкоза (С6Н12О6) + 6О2 -> 6СО2 + 6Н2О + 670ккал).

Дыхание зависит от температуры. Данный процесс протекает при температуре не ниже+10 и не выше +46-50 ºС. При дыхании энергии образуется в 20 раз больше, чем при гликолизе. Обязательно присутствие кислорода. Окисляются сначала углеводы, потом липиды, потом белки. На стадии окисления белков в работе может быть использован генетический материал самих спермиев. Для осуществления этого процесса необходимы ферменты цитохромоксидаза, карбоксилаза, дегидрогеназа. Дыхание усиливается с повышением температуры. Повышение (понижение) на 10 ºС усиливает (снижает) дыхание в 2 раза. Щелочная среда повышает интенсивность дыхания, кислая – снижает.

Гликолиз

Заключается в том, что углеводы в отсутствие кислорода могут распадаться на молочную кислоту, при этом выделяется энергия. Глюкоза -> 2 С3Н6О3 (молочная кислота) + 50 ккал.

Фермент: дегидрогеназа (в предстательной железе).

Гликолиз свойственен животным с коротким актом спаривания (баран, бык). Используются только углеводы. В результате образуется молочная кислота, которая наиболее вредна для спермиев.

2 типа спермы:

- быка и барана – густая сперма с большим количеством углеводов

- хряка, кобеля – мало углеводов, фруктолиз (гликолиз) выражен незначительно.

Образующуюся молочную кислоту половые клетки выделяют во внешнюю среду, она обладает способностью тормозить или приостанавливать биологические процессы в спермиях, последние впадают в состояние анабиоза. Первая фаза (рН больше 6) – спермии неподвижны в комнатной температуре. Если нагреть до 38-40 ºС – начинают двигаться. рН ниже 6 – вторая стадия, сперму кроме нагревания разбавляют щелочными растворами.

Гликолиз наиболее интенсивно происходит при рН = 7,4 – 7,6

Распад АТФ

АТФ, соприкасаясь с фибриллами осевой нити, может распадаться на АДФ, в результате образуется 12 ккал – обеспечивается движение хвостика спермиев. Обратимая реакция. Энергия для обратимости берется или из процесса дыхания, или из процесса гликолиза.

Если бы не было распада АТФ, животные быстро бы теряли тепло, так как энергия бы очень быстро расходовалась. Реакция распада АТФ позволяет восстанавливать энергию клеток.

Осмотическое давление спермиев, депрессия спермы

Осмос и осмотическое давление

Осмос – движение растворенных частиц через полупроницаемую мембрану или между растворами разной концентрации или между растворителем и растворяемой жидкостью.

Осмотическое давление – давление, при котором происходит осмос. Выражается в атмосферах.

Величина осмотического давления в среднем (в половых клетках, плазме и т.д.) = 7 атм. (6,95 атм.).

1. Изотоническая среда: количество растворенных веществ в спермии = количеству растворенных веществ за его пределами.

2. Гипотоническая среда: количество растворенных веществ в спермии выше, в плазме ниже.

3. Гипертоническая среда: количество растворенных веществ в плазме выше, в спермии ниже.

Правила приготовления искусственных сред:

1) Растворитель – дистиллированная или бидистиллированная вода;

2) Все компоненты строго взвешивают.

2 подхода:

1) Изотоничность приготовленного раствора можно определить криоскопически. Используют термометр Бекмана;

2) Биологический способ (оптимальный, более точный).

Криоскопический способ расчета

В биологии для расчета осмотического давления используется «депрессия». Депрессия – разница между точками замерзания дистиллированной воды и биологического объекта.

Дистиллированная вода переходит в твердое состояние при температуре -4,72 ̊С. Точка замерзания спермы = -4,12 ̊С. Величина депрессии = 0,60 (для быка). У барана 0, 64, жеребец 0, 57, хряк 0,62.

Если взять 1 г/мол (грамм-молекулу) любого вещества и растворить её в 22, 4 л дистиллированной воды, величина давления = 1 атм.

Если взять 1 г/мол любого вещества, растворить в 1 л дистиллированной воды, то величина давления будет = 22,4 атм.

Если 1 г/мол любого вещества растворить в 1 литре воды, то величина депрессии будет = -1,86 ̊

Расчет изотоничности для углеводов.

C₆H₁₂O₆: 6*12 + 12 + 16*6 = 180 (молярная масса)

180 г – 22,4 атм. (давление 180 г глюкозы) 7 атм. – давление половой клетки.

Чтобы получить изотонический раствор глюкозы, нужно взять 60 г глюкозы (т.е. 6% раствор).

180 г - -1,86 ̊ (депрессия 180г глюкозы в 1 литре воды)

Депрессия половой клетки = -0,57.

Чтобы получить изотоничный раствор, нужно взять примерно 60 г глюкозы (т.е. 6% раствор).

Расчет изотоничности для электролитов.

При этом учитывается I (коэффициент изотоничности) – указывает, на какое количество ионов диссоциирует данный электролит.

NaCl. Диссоциация на Na⁺ и Cl^-. Коэффициент изотоничности (i) = 2

Чем на большее количество ионов диссоциирует данное вещество, тем выше величина депрессии.

NaCl. Молярная масса = 23+35 = 58

58 г – 22,4 атм.

Х = 7 атм.

Х = 19г (количество растворяемого вещества), т.е. 1,9% раствор.

19/i = 9,5 (так как депрессия зависит от коэффициента изотоничности.

Биологический метод

Базируется на криоскопическом методе, после соответствующих выполненных расчетов в штатив устанавливают 7 чистых теплых пробирок. 1 мл 0,95% раствора хлорида натрия добавляют в среднюю пробирку, столько же к изучаемой сперме. В правую пробирку от средней наливается 0,94% раствор, в следующие 0,93 и 0,92%. Влево: 0,96, 0,97, 0,98%. Определяют активность спермы, штатив помещают в температуру +2-4 ̊С. Определяют активность спермы в растворах с разной концентрацией. Вычисляют тот, в котором активность выше всего.

На теплое предметное стекло с промежутком в 1 см наносят 3 капли спермы. К 1й добавляется дистиллированная вода, ко второй 1% раствора хлорида натрия, к третьей капле 3% раствор. Смотрят, в котором спермии дольше живут.