Замораживание спермы в соломинках

Замораживание спермы быка в полипропиленовых соломинках (пайетах). Технология была разработана в 1975 году во Франции ученым Л. Кассу. Соломинки объемом 0,5 мл, диаметр 3мм. Для разбавления спермы быка в настоящее время используют среду ЛГЦЖ (лактозо-глицерино-цитратно-желточная среда). В зависимости от активности и концентрации полученной спермы её разбавляют от 20 до 50 раз, с таким расчетом, чтобы в 1 дозе было не менее 15 млн. половых клеток. После предварительной оценки сперму переливают в смеситель с емкостью 100-200мл и измеряют объем, разбавитель при температуре +25-30ёС небольшими порциями приливают по стеночке, перемешивают. В последующем, прежде чем приступить к фасовке, заполнению соломинок. Прежде чем в специальной машине под действием вакуума происходит заполнение соломинок, концентрация половых клеток должна быть равномерной (магнитные мешалки). Машина маркирует соломинки: название предприятия, кличка быка, инвентарный номер, дата получения спермы, номер серии. Чтобы сперма не вытекла: 1) укупоривание концов с помощью стеклянных шариков; 2) укупоривание с одной стороны пробкой из нетоксического для спермиев волокна, с другой стороны склеивают. После наполнения соломинок между спермой и одним из шариков или пробкой остается воздушный пузырек. Чтобы воспрепятствовать попаданию жидкого азота внутрь соломинок, пузырек перемещают в середину соломинки путем энергичного встряхивания. После чего пайету помещают в штатив и ставят в холодильник при температуре 2-4 ̊С на 3-4 часа. Прием называется «эквилибрация». Замораживают сперму по этой технологии на специальном железном щите в стационарном хранилище в газообразном азоте при температуре -150 ̊С, время – 7 минут. Пайеты выпускаются объемом 0,33 мл и 0,25 мл. Одновременно замораживают до 750 соломинок. После замораживания пайеты со спермой перемещают в пластмассовые стаканы, предварительно наполненные жидким азотом. Для сбора соломинок используют специальный собиратель с деревянной ручкой. Хранят замороженную сперму в стационарных хранилищах в пластмассовых стаканах, полностью погруженных в жидкий азот.

Порядок оттаивания спермы, замороженной по разным технологиям, и её оценка на пункте ИО

Атрибуты

1. Наличие водяной бани.

2. Наличие корнцанга или пинцета.

3. Перчатки, очки.

4. Цитрат натрия.

5. Чистые пенициллиновые флаконы.

Оттаивание спермы, замороженной в виде соломинок

Соломинки бывают объемом 0,25 или 0,33 мл.

Правой рукой в перчатке открывают сосуд с жидким азотом, где хранится сперма. Левой рукой поднимают контейнер, в котором находится сперма. Поднимают крышку. В правую руку берут пинцет, бранши пинцета в течение 10 секунд охлаждают в парах жидкого азота (иначе соломинка приклеится). С помощью охлажденных браншей пинцета из пенала или алюминиевого пакета извлекают нужное количество соломинок. Их встряхивают, чтобы освободиться от излишнего количества азота. Немедленно переносят их для оттаивания в водяную баню. В том случае, если из жидкого азота по каким-то причинам извлекли соломинку со спермой другого быка, её уничтожают (обратно убирать нельзя).

Оттаивание спермы в соломинках проводят при 38 ̊С в течение 10 секунд. За это время сперма достигает температуры 0 ̊С. Соломинки вынимают, насухо протирают стерильной салфеткой. Одновременно можно оттаивать такое количество замороженной спермы (независимо от технологии), которое техник по ИО может использовать в течение 10 минут (обычно 1, иногда 2). Оттаивать лучше в горизонтальном положении, поэтому рабочие размеры водяной бани должны соответствовать длине соломинки (примерно 150 мм).

Оттаивание спермы в виде необлицованных гранул

При объеме гранулы 0,1-0,2 мл.

Стерильный пенициллиновый флакон. Цитрат натрия (2,9%). Водяная баня ёмкостью на 1 литр. Пинцет.

Правой рукой снимают крышку, левой рукой канистру выдвигают до горловины, остужают бранши пинцета, марлевый мешочек (горловину) прижимают к стенке сосуда с жидким азотом. С помощью ножниц разрезают часть мешочка, остуженными браншами пинцета извлекают гранулу.

Гранулу помещают в пенициллиновый флакон с 1 мл цитрата натрия, прогретого до + 38-40 ̊С на водяной бане (1 минута). Оттаивание происходит при 38-40 ̊С, то есть его помещают на водяную баню (удерживают в руках, покачивая, в течение 8-10 секунд, пока не исчезнет стерженек льда).

При объеме гранулы 0,5 мл.

Пенициллиновый флакон (стерильный), водяная баня, пинцет.

Правой рукой убирают крышку, канистру поднимают к горловине, остужают пинцет, вскрывают марлевый мешочек, извлекают 2 гранулы,помещают в пенициллиновый флакон, прогретый в течение 1 минуты при 38-40 ̊С. оттаивание при той же температуре в течение 8-10 секунд (на водяной бане).

Оттаивание спермы, замороженной в виде облицованных гранул

Объем гранул 0,25 или 0,33 мл.

Водяная баня, пинцет.

Остужают бранши пинцета в парах жидкого азота, подтягивают пенал, извлекают 1 гранулу. Её помещают в водяную баню (просто в воду) при 38-40 ̊С на 8-10 секунд. Если оболочка прозрачная, то после извлечения гранулы видно исчезновение стерженька льда. От остатков воды гранулу освобождают марлевой салфеткой. Затем оценивают активность каждой гранулы. Если оболочка из темного стекла, то одна гранула вскрывается, содержимое выдавливают на предметное стекло, определяют активность.

Криогенное оборудование. Техника безопасности при работе с сосудами Дьюара. Транспортировка спермы

Сосуды для замораживания спермы.

Стационарное хранилище для хранения замороженной спермы: ХБ – 0,5 (хранилище биологическое – 0,5 тонны), ХСЖА (хранилище стационарное для жидкого азота, тонна и более), КВ 6202 (емкость такая же). Использование этих сосудов позволяет хранить замороженную сперму без подзарядки жидким азотом около 3 месяцев. Сосуды типа СДП-6 – СДП-90 предназначены для стационарного хранения и транспортировки жидкого азота. Сосуды типа СДСТ или СДС – с более широкой горловиной.

Контейнеров малой емкости: СДС–6 – СДС-10.

Для транспортировки: используют термосы, сосуды Дьюар, СДС и другие.

Замораживают сперму в стационарном хранилище типа КВ-6202 или ХБ-0,5 в газообразном азоте при температуре -150± 20°С, на щите из нержавеющего металла толщиной 1,5-2 мм. Одновременно замораживают до 750 спермодоз. Цикл замораживания продолжается 7минут.

Уровень жидкого азота при замораживании с обдувом необходимо поддерживать на расстоянии 6-8 см до щита замораживающего устройства. При замораживании спермы без обдува щит замораживающего устройства должен касаться поверхности жидкого азота. При этом штативы с соломинками располагают в один ряд. Изменение температуры спермы и испаряющегося газообразного азота контролируют самопишущим потенциометром КСП-4 с подключенными медно-константановыми термопарами.

После замораживания соломинки со спермой помещают в пластмассовые стаканы или тубы, предварительно наполненные жидким азотом. Для сбора соломинок используют специальный собиратель с деревянной рукояткой. Его металлическую часть охлаждают в жидком азоте, затем вставляют в штатив, осторожно проводят вдоль него, в результате чего все соломинки ссыпаются в собиратель. После этого соломинки поворачивают и перекладывают в пластмассовые стаканы для хранения в стационарном хранилище.

Хранят замороженную сперму в стационарных хранилищах типа КВ-6202, ХБ-0.5 или ХБ-0,2 в пластмассовых стаканах, полностью погруженных в жидкий азот. Канистры с поднимателем стаканов заранее должны быть помещены в хранилище.

Техника безопасности при работе с сосудами Дьюара

1. Защитные очки, кожаные перчатки во время заливки жидкого азота.

2. В помещении вентиляция, горловину сосуда плотно не закрывают (чтобы не было повышения давления паров азота).

3. Из транспортного резервуара при заливке азота шланг спускают на дно сосуда.

4. Не наклонять лицо над горловиной сосуда.

5. Оберегать сосуд от резких толчков и ударов.

Методы получения спермы

Требования

1. Получение всего объема эякулята;

2. Не должно происходить снижение количества и жизнеспособности спермиев;

3. Гарантия здоровья производителей. Метод не должен затормаживать появление половых рефлексов, приводить к появлению травм, распространению инфекционных заболеваний;

4. Должен быть простым и доступным в условиях производства.

Существует 3 группы методов для получения спермы.

Влагалищные

Губочный метод

Разработан в 1892 году И.И. Ивановым для получения спермы от жеребцов при ИИ кобыл. При этом использовалась морская губка, обязательно с наличием пор. Сущность: предварительно к этой губке с порами привязывали прочную нить 20-30 см в длину, её смачивали теплым (38-40 ̊̊С) изотоничным физиологическим раствором, после чего с помощью стерильного корнцанга губку вводили в половые пути кобылы, у которой проявлялся феномен охоты. После акта спаривания за нить губку извлекали, помещали под пресс, собирали эякулят. Широко применялся до 1931 года.

Недостатки:

1. Удавалось собрать только 1/8 эякулята;

2. Когда посмотрели под микроскопом, в нескольких полях зрения спермии были повреждены - значительная травматизация спермиев;

3. Происходило смешивание эякулята с содержимым влагалища;

4. Метод способствовал распространению заразных заболеваний среди животных.

Влагалищный метод

1931-1932 гг, разработан для получения спермы от быков. Сущность: после акта спаривания из половых путей физиологически зрелых телок или коров эякулят собирали с помощью влагалищного зеркала, длинной пипетки со шприцом или с помощью ложки с длиной ручкой.

Недостатки:

1. Потеря значительной части эякулята;

2. Разбавление спермы влагалищным содержимым;

3. Распространение инфекционных заболеваний;

4. Снижение количества половых клеток.

Хирургические

Предусматривает хирургическое вмешательство, может быть использован в редких случаях в заповедниках, зоопарках, цирках, когда производитель (высокоценный или единственный) находится на грани жизни и смерти (переломы конечностей, серьезные отклонения в работе ССС, состоянии печени и других заболеваниях незаразной этиологии).

Перед убоем производят двустороннюю кастрацию, из хвостовой части придатка семенника получают высококонцентрированную небольшую каплю (под прессом).

При дефиците производителей и большом количестве самок животных возможно проведение односторонней кастрации с получением содержимого из хвостовой части придатка семенника.

Уретральные

Получение спермы от баранов, быков, жеребцов с помощью резиновых спермособирателей

Тупо заканчивающийся резиновый двустенный мешок, для каждого вида животных своя разновидность, с наличием 1 или 2 колец для фиксации. В некоторых конструкциях внутри имеется резиновый клапан для предупреждения смешивания спермы с содержимым влагалища и чтобы эякулят не изливался за пределы спермособирателя.

Порядок использования:

1. Стерилизация. 1) кипячение в течение 20 минут после закипания воды в стерилизаторе. Качество спермы снижается за счет избыточного количества воды. Избавляться: берется изотоничный (7%) раствор сахаров, стерильный, набирают в 20 граммовый шприц и орошают спермособиратель изнутри; 2) обработка внутренней и наружной поверхности ватным тампоном, смоченным 70% спиртом (корнцангом);

2. При наличии самки с феноменом охоты спермособиратель размещают внутри половых органов самки, происходит половой акт, после спермособиратель извлекают, содержимое помещают в стерильную градуированную стеклянную емкость.

Достоинства:

1. Удается получить весь эякулят;

2. Не происходит контакта с содержимым влагалища;

3. Не происходит снижения концентрации половых клеток;

4. снижается возожность распространения инфекционных заболеваний.

Получение спермы путем массажа ампул спермиопроводов, пузырьковидных желез и тазовой части мочеполового канала.

Только у крупных животных, ректальным способом.

В 1934 году разработан Миллером и Эвансом для получения спермы от жеребца.

Удается получить сперму от производителей с патологией репродуктивной системы. Выдерживают в загоне 5 минут, на рабочую руку надевают перчатку, смазывают, ректальным путем в течение 2-3 минут (не более) осуществляют массаж: ампулы – пузырьковидные железы – тазовые части мочеполового канала. В этом случае сперма выделяется даже без эрекции, сперма собирается в стеклянную посуду.

Фистульный метод

Используется только в научных целях. Позволяет получить сперму с низкой микробной загрязненностью. В области промежности, отступя от анального отверстия на 15-20 см вниз, выполняют уретростомию с искусственной (силиконовой) фистулой. Для получения спермы от быка и жеребца.

Послеоперационный период 3-4 недели, после чего от производителей можно получать сперму. Предварительно область корня хвоста бинтуют, края фистулы протирают ватными тампонами, смоченными или 50-60% этиловым спиртом, или раствором борной кислоты. Перед актом спаривания хвост у производителя отводят в сторону, к фистуле приставляют емкость для сбора спермы, в момент эякуляции сперма выделяется через фистулу.

Метод мастурбации

На 99,9% применяют для получения спермы от кобелей, в пушном звероводстве от самцов лис, енотовидных собак.

Сущность: с помощью пальцев руки осуществляют раздражение через препуций нервных рецепторов на головке полового члена, у кобелей ритмично сжимают и разжимают пальцы в области луковицы полового члена, возникает эрекция, сперму собирают в специальный сосуд (теплый).

Мануальный метод получения спермы от хряков

После проявления эрекции оператор по получению спермы захватывает половой член пальцами руки в стерильной перчатке, воспроизводит физиологический процесс нахождения полового члена в канале шейки матки у свиноматки, отводит половой член в сторону и собирают сперму в спермоприемники.

Электроэякуляция

Предусматривает использование прибора, используется в числе прочих у людей.

Строение: эбонитовый стержень с 2 бронзовыми кольцами, понижающий трансформатор, секундомер.

Животных фиксируют в станке, обрабатывают область промежности, эбонитовый стержень смачивают теплым физиологическим раствором для увеличения чувствительности, наконечник вводится в прямую кишку. Параметры: интервал для барана 4-5 секунд, быка 20-30 секунд, барану 3-6 импульсов, быку 5-10, напряжение быку 10-20 вольт, барану 2-10 вольт. Удается собрать несколько капель спермы.

После использования этого прибора другим путем сперму получить уже не удается.

Метод искусственной вагины

Представляет собой прибор с определенными конструктивными особенностями для разных видов животных. Удалось создать необходимые условия:

1. температура 40-42 ̊С;

2. давление 40-60 мм. рт. ст.

3. скольжение.

Основные части: корпус (цилиндр), резиновая камера, спермоприемник.

Бык: корпус 2х видов. 1) из толстой резины; либо укороченный, из толстой резины; 2) из сплава алюминия (дюралюминиевый) с расширением ближе к одному из концов.

Бараны и козлы: корпус из эбонита.

Хряк: корпус укороченный из толстой резины либо двойной корпус из оцинкованного железа.

Жеребец: корпус дюралюминиевый образца 1952 года.

Резиновая камера имеет 2 поверхности, различается только размером. Наружная шероховатая и гладкая внутренняя поверхности. Штамп стоит на шероховатой поверхности.

Спермоприемники: различие зависит от температуры помещения. Если температура ниже +20 градусов - двустенные водоналивные спермоприемники. Если температура +20 и выше: для быка – двустенный спермоприемник, одностенный, одноразовый. Баран: двустенный стеклянный, одностенный. Хряк: одноразовый, пластмассовый (20-250мл), банка из темного стекла (0,5 л). Жеребец: резиновый толстостенный стакан.

Дополнительные части: резиновые кольца, краник для накачивания воздуха в межстенное пространство (бык, баран). Резиновый держатель для спермоприемника (бык). Поролоновая накладка – чтобы предупредить попадания примесей к сперме (опил, волосы и т.д.).

План подготовки искусственной вагины:

1. Приготовление спермоприемника;

2. Дезинфекция вагины;

3. Наливание теплой воды (60-70 ̊С);

4. Смазывание искусственной средой или разбавителем («вазелин»);

5. Закрепление спермоприемника;

6. Нагнетание воздуха (40-60 мм.рт.ст.);

7. Измерение температуры (40-42 ̊С);

8. Обработка вагины после работы (2% раствор двууглекислой или 1% раствор кальцинированной соды, омывание горячей водой и просушивание).

Новые цилиндры и камеры с целью удаления заводских примесей моют с помощью горячего 3% раствора гидрокарбоната натрия, затем ополаскивают чистой водой и высушивают. Перед сборкой вагины острые края цилиндра стачивают. Резиновую камеру пропускают в цилиндр так, чтобы гладкая поверхность была направлена внутрь, после чего концы выравнивают, выворачивают, поочередно натягивают на края цилиндра без наличия складок. Концы камеры закрепляют на кормусе при помощи 4 резиновых колец. Стерилизацию вагины можно осуществлять в автоклаве ри температуре 105 градусов и давлении 0.3-0.4 атм в течение 20-30 минут, предврительно на концы вагины одевают пергаментную бумагу, фиксируют при помощи резиновых колец. Второй способ - кипячение в специальном стерилизаторе, в кипящей дистиллированной воде в течение 20-25 минут. Затем вагину извлекают из автоклава или стерилизатора, дают стечь воде. Для хранения помещают в термостат (+40-42 градуса). Дезинфекцию внутренней поверзности резиновой камеры осуществляют ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле, с использованием корнцанга. Через отверстие в патрубке в корпуса резиновых камер наливают теплую воду: баранам – 150-180 мл воды, температура 50-55 ̊С, быкам (1942г) – 400-500 мл воды температурой 60-70 ̊С, в укороченный корпус 300 мл (60-65 ̊С), хрякам (оцинкованная) – 1200 мл 60-70 ̊С, жеребцам 1,5-2 литра (50-60 ̊С). В межстенное пространство спермоприемника для быка 100 мл воды температурой 30-35 ̊С, барану 50 мл температурой 25-30 ̊С