Суперовуляция. Способы извлечения эмбрионов

Для вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота используются гонадотропные препараты (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл - ГСЖК и фолликулостимулирующий гормон - ФСГ - гипофиза животных), для синхронизации половых циклов - аналоги простагландина Ф2-альфа (эстрофан, магэстрофан, клопростенол, суперфан, ремофан, клатрапростин, эстуфалан и др.). Препараты ГСЖК обладают комплексной фолликулостимулирующей и лютеинизирующей активностью. Период полураспада экзогенного ГСЖК у коров составляет около 6 дней. Соотношение ФСГ и ЛГ в различных партиях неодинаковое, что сказывается на результативности суперовуляции. Стимуляция роста фолликулов препаратами ГСЖК сопровождается, как правило, увеличением массы яичников, образованием после овуляции разного числа и величины желтых тел. Из-за длительного распада ГСЖК в крови животных накапливаются повышенные концентрации гормонов. Изменение эндокринного статуса при индукции суперовуляции может оказывать неблагоприятное действие на оплодотворяемость яйцеклеток, развитие зародышей, а также на физиологическое состояние половых органов (в частности, наблюдается кистозное перерождение яичников). Для исключения длительной стимуляции роста фолликулов применяется анти-СЖК. Обработка антисывороткой в день проявления охоты нейтрализует циркулирующую в крови животных ГСЖК и тем самым прекращает дальнейшую стимуляцию роста фолликулов в яичниках. Это создает более благоприятный фон для овуляции, оплодотворяемости яйцеклеток и последующего развития зародышей. В практике используются стандартные гонадотропные препараты высокой степени очистки: сергон (Чехия), фоллигон (Голландия), прегмагон (Германия). Эти препараты инъецируют донорам на 11-12-ый день полового цикла, однократно, в дозе 50 И.Е. на 100 кг живой массы животного. Применение этих гонадотропинов обеспечивает вызывание множественной овуляции у 75-78% животных и получение в среднем 3,5-4,0 жизнеспособных эмбриона на донора.

Опыт работы по вызыванию суперовуляции у коров-доноров сывороточными и гипофизарными препаратами показал, что при использовании гипофизарных гормонов (ФСГ-п, ФСГ-супер, фолликотропин, фоллитропин) получаются более стабильные и высокие результаты суперовуляции и эмбриопродукции (табл.1). Так, процент коров-доноров, реагирующих на обработку сывороточными гонадотропинами, составил 75,0-78,3%, гипофизарными препаратами - 85,3-88,8%, число овуляций на донора - соответственно 8,3-9,7 и 10,2-12,0, количество пригодных эмбрионов - 3,5-4,0 и 5,5-6,1.

Используют бластоцисты и морулы, между 7 и 8 сутками. Оплодотворённые яйцеклетки можно извлечь 3 способами.

1. После убоя доноров. Самый простой, надёжный, 100% способ.

2. Хирургический – через разрез верхнего свода влагалища,.лапаротомия в области голодной ямки, лапаротомия по белой линии живота.

3. Нехирургический. Достоинства: простота манипуляций в производственных условиях, многократное использование доноров, без голодной диеты. Извлекают на 7-8 день после осеменения. Можно фиксировать, можно не фиксировать животное.

Прямую кишку освобождают от кала, дезинфицируют, низкая сакральная анестезия, миорелаксант внутримышечно. Для извлечения эмбрионов используют 4 вида катетеров. Катетеры: Прокофьева, Сергеева, Микояна.

При не хирургическом способе извлечения зародыше животных фиксируют в станке. Прямую кишку освобождают от содержимого и проводят тщательное ректальное исследование. Определяют, сколько желтых тел находится в каждом яичнике. Хвост с помощью тесемки фиксируют. Проводят туалет и дезинфекцию наружных половых органов и промежностей. Для прекращения перистальтики прямой кишки эпидурально вводят 10 мл 2%-ного раствора новокаина. Для вымывания зародышей из матки применяют различные инструменты. Используют гибкий одноходовой катетер Фолея с упругим мандреном и надувным баллончиком. Инструмент должен быть стерильным. Сначала катетер вводят во влагалище по верхнему его своду и проводят под ректальным контролем через канал шейки матки в рог матки. Для более полного извлечения зародышей нужно, не травмируя слизистую оболочку, как можно глубже ввести инструмент в рог матки после того как катетер достигнет в роге матки необходимого положения, мандрен удаляют и в баллончик катетера накачивают 10–15 мл воздуха. При этом катетер фиксируется в роге матки и промывная жидкость не вытекает мимо катетера.

Закрепив катетер, промывают полость рога матки с помощью шприца Люэра вместимостью 50–60 мл. В рог матки в зависимости от его величины вводят порциями от 40–60 мл промывной жидкости, затрачивая на промывание каждого рога не более 500 мл. Наполнение матки промывной средой и степень ее оттока контролируют ректально.

Для более полного извлечения зародышей верхушку рога матки приподнимают и выпрямляют. Некоторые авторы рекомендуют яйцепровод вблизи верхушки рога матки осторожно зажать большим и указательным пальцами. При этом предотвращается поступление в брюшную полость жидкости, содержащей зародыши. Но практика показывает, что поступление в брюшную полость жидкости из рога матки отмечается только при наличии большого давления в матке, поэтому яйцепровод можно не зажимать. Перед извлечением катетера следует удалить воздух из баллончика. Таким же образом промывают и второй рог.

В качестве среды для промывания используют фосфатно-буферный солевой раствор (ФБС) Дюльбекко.

Раствор готовят на тридистиллированной воде. Первые 4 вещества растворяют 800 мл, а 5-е и 6-е каждый отдельно в 100 мл. в итоге получают три раствора которые автоклавируют, а затем смешивают. В таком виде их можно хранить при 4 градусах до 2 недели. Непосредственно перед употреблением в ФБС вводят следующие компоненты (в расчете на один литр): альбумин бычьей сыворотки – 4г; глюкоза – 1г; натрий-пироват – 0,036г; пенициллин – 100 тыс. ЕД.

Собранную в цилиндр промывную жидкость отстаивают 20–35 мин. при температуре 20–37 градусов, чтобы зародыши опустились на дно, после чего верхний слой удаляют с помощью сифона. Нижний слой жидкости порционно по 20–30 мл для обнаружения зародышей исследуют в больших часовых стеклах или чашках Петри под бинокулярной лупой при 10–50-кратном увеличении. Найденных зародышей при помощи пастеровской пипетки переносят в среду для кратковременного хранения (среда Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка). После оценки зародышей их культивируют при 37 градусах до момента пересадки или оставляют для хранения.

Оценка и культивирование зародышей

Оценка качества эмбрионов

Морула (6 день); Ранняя бластоциста (7 день), бластоциста (8-9 дней).

В лаборатории или отдельном помещении ветеринарного пункта температура в пределах 20-25 ̊С. За 3 часа до работы помещение обрабатывают при помощи УФ ламп (1Вт на 1 м³).

После промывания каждого из рогов матки цилиндры тс эмбрионами переносят в стерильный бокс. Осаждение эмбрионов в течение 20 минут. Работу проводят в термостате при температуре 37 ̊С. Верхнюю часть жидкости из сосуда удаляют шприцом, оставляют 60-100 мл. Оставшуюся жидкость с эмбрионами переносят в 2-3 чашки Петри.

Каждый отдельный эмбрион с помощью специального микрошприца переносят в часовое стекло (миниатюрная чашка Петри), для кратковременного хранения используют 1 мл питательной жидкости.

Чтобы оценить целостность морфологических структур, используют микроскоп с увеличением 160-180 или увеличительное стекло. Обращают внимание на форму зиготы (морула, ранняя или поздняя бластоциста), состояние зоны пеллюцида, число блатомеров, равномерность их дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта. Полноценные: шарообразная форма, неповрежденная прозрачная оболочка (зона пеллюцида), одинаковыебластомеры с четкой плазматической оболочкой, светлая гомогенная цитоплазма. Экспресс-метод определения жизнеспособности.

Классификация эмбрионов

Отличные – идеально соответствуют стадиям развития. Округлая форма. Нет видимых нарушений морфологии. зародышевые клетки однородные по цвету.

Хорошие – незначительные отклонения. Неравномерное увеличение 2-3 бластомеров, до 5 клеток мертвые, форма яйцевидная.

Посредственные (сомнительные) – используют, когда возникает дефицит отличных и хороших. Степень их приживаемости не больше 10-12%. Эмбрионы подвержены дегенеративным изменениям, отстают в своем развитии. В зародышевых клетках имеет место просветление зародышевой массы. 20 и более мертвых клеток. Разрастание отдельных бластомеров в 3 и более раз.

Плохие – приживаемость не более 1-3 %. Отстают в развитии, дробление бластомеров заторможено, 50% клеток дегенерировано.

Метод флуоресцентных красителей

Основан на различной степени проницаемости красок через прозрачную оболочку живых и мертвых эмбрионов.

Эмбрион помещают на предметное стекло, добавляют какой-то из красителей (синька Эванса, акридин-оранж, краска FDA, ДАР). Требуется не более 1,5 минут.

Метод культивирования (биологический метод оценки). Основывается на тех изменениях биологических процессов, которые возникают в структурах эмбрионов. Для культивирования применяют различные питательные среды. Самый простой: культивирование в пробирках или соломинках. Эмбрион переносят в пробирку с 1 мл питательной среды + 2-3 мл вазелинового масла (среда Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка).

0,25 мл переносят в соломинку или пробирку, ставят в термостат при температуре 37 ºС в шприце. Эмбрионы в культуре продолжают развитие в 90% случаев. Стельность более 50% на разных стадиях. При работе с эмбрионами шприцы инсулиновые.

Найденных зародышей при помощи пастеровской пипетки переносят в среду для кратковременного хранения (среда Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка). После оценки зародышей их культивируют при 37 градусах до момента пересадки или оставляют для хранения.

Способы пересадки эмбрионов

В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хирургическим и нехирургическим способами. При пересадке нужно точно знать местонахождение эмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходом предимплантационного периода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новый период эмбрионального развития – имплантационный.

При естественном течении эмбрионального периода зародыш на стадии морулы или бластоцисты находится в верхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для его аппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, что пересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечивается хирургическим способом. При нехирургической же пересадке, которая происходит в период диэструса, место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менее точно. Эффективность хирургического способа пересадки эмбриона составляет 60–70%, а число телят – 3–4 на донора. Хирургический способ использовали в основном до середины 70-х годов. Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применение хирургического метода сдерживается сложностью проведения операций в производственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, и невозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последние 10–15 лет пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическим способом. При нехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты и экономичности, является возможность многократного использования реципиента. Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако все они основаны на одном принципе – введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чего этот способ назван также цервикальным.

После пересадки эмбрионов проводят наблюдение за реципиентами, обращая особое внимание на возможное проявление у них повторной половой охоты. Для установления стельности у коров-реципиентов используют несколько методов: визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке; клинический, главным образом путем ректальной пальпации.

Профилактика эмбриональной смертности – инъекция прогестерона.

Бесплодие и яловость

Оптимальное состояние воспроизводства стада: 50% коров стельные, 17% в послеродовом периоде, 33% осемененные, но не проверенные на стельность.

Высокая молочная продуктивность не приводит к снижению воспроизводительной способности. выход телят должен составлять порядка 86%.