Тема: «Природа и свойства ферментов» (занятия 5-9)

Цель: изучить химическую природу, функции и свойства биологических катализаторов – ферментов.

Значение темы. Обмен веществ – обязательная и важнейшая особенность живых организмов – слагается из множества разнообразных химических реакций, в которые вовлекаются соединения, поступающие в организм извне и соединения, имеющие эндогенное происхождение. В процессе изучения данного раздела дисциплины усваивается то, что все химические реакции в живом протекают при участии катализаторов, что катализаторы в живом (ферменты или энзимы) являются веществами белковой природы, что свойства ферментов, их поведение зависит от характеристик среды.

При изучении этого раздела приобретаются также сведения о том, как в целостном организме регулируется активность ферментов, и создаются общие представления о связи ряда патологических процессов с изменением активности или количества ферментов, сведения о принципах количественной характеристики ферментов, об их использовании в диагностических и терапевтических целях.

Занятие 5 (Влияние температуры и реакции среды на каталитическую активность ферментов. Специфичность ферментов)

 

Цель занятия: изучить свойства ферментов, обусловленные их белковой природой.

Студент должен знать:

1. Прямые и косвенные доказательства белковой природы ферментов а также то, что ферменты могут иметь структуру простых и сложных белков.

2. Соединения, выполняющие функцию простетической группы ферментов.

3. Принципы классификации ферментов, современную классификацию и номенклатуру.

4. Свойства ферментов и факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.

5. Как регистрируется активность фермента. Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.

6. Что представляет собой активный и каталитический центры фермента

7. Способы выражения активности ферментов.

Студент должен уметь:

1. Расшифровать функцию фермента по его химическому наименованию.

2. Назвать субстрат фермента по химическому наименованию.

3. Рассчитать активность фермента по данным, полученным в экспериментальной системе, в которой после внесения исследуемого фермента через определенное время установили количество превращенного субстрата.

4. Распознать среди перечня химических соединений те из них, которые могут играть роль коферментов.

5. Определять температурный и рН-оптимум фермента.

6.. Строить графики зависимости скорости реакции от температуры, рН среды и концентрации субстрата, находить константу Михаэлиса.

Студент должен получить представление:

1) о существовании заболеваний, обусловленных наследуемыми дефектами генов, ответственных за продукцию белков-ферментов,

2) о возможностях, которые предоставляет энзимология практической медицине,

3) о лечебном применении энзимов в диагностике и терапии (энзимодиагностике и энзимотерапии),

4) о принципах хранения ферментативных препаратов

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения т емы:

1) сведения о связи структуры и функции в молекуле белка;

2) сведения о факторах, стабилизирующих белковую молекулу, и факторах, повышающих лабильность белковой молекулы,

3) сведения о влиянии температуры и рН среды на диссоциацию.

 

Аудиторная работа.

Лабораторные работы

1. Влияние температуры на каталитическую активность амилазы слюны. Амилаза слюны катализирует расщепление крахмала через стадию образования декстринов до дисахарида мальтозы, которая обладает восстанавливающими свойствами. О действии фермента можно судить по исчезновению субстрата амилазы (крахмала) или по образованию конечных продуктов расщепления.

Крахмал обнаруживается пробой Люголя (синее окрашивание со свободным йодом). Мальтоза открывается реакцией Троммера (при нагревании с восстанавливающим сахаром гидрат окиси меди восстанавливается сначала в гидрат закиси желтого цвета, затем - в закись меди кирпично-красного цвета).

Ход работы. В четыре пробирки отмерить по 4 мл 0,5%-ного раствора крахмала и по 1 мл слюны, разведенной в 10 раз водой. 1-ю пробирку поместить в кипящую водяную баню, 2-ю - в ледяную баню, 3-ю - в термостат при 37⁰ С, 4-ю - оставить при комнатной температуре. Через 10 мин содержимое каждой пробирки разделить на две примерно равных части.

С одной частью провести пробу на крахмал, с другой - на восстанавливающий сахар (пробы Люголя и Троммера соответственно):

1) к содержимому пробирки добавить 2 капли раствора Люголя – появление синего окрашивания свидетельствует о наличии крахмала;

2) к содержимому пробирки добавить 1 мл 10%-ного раствора едкого калия и по каплям вносить 1%-ный раствор сернокислой меди до образования неисчезающего осадка (муть на фоне голубой окраски раствора); затем нагреть до кипения - появление желтого окрашивания, переходящего в кирпично-красное, указывает на наличие восстанавливающих углеводов.

Сравнить результаты проб, проведенных при разных температурах, и сделать выводы.

2. Влияние рН на действие ферментов. Зависимость активности ферментов от концентрации Н-ионов можно проследить в опытах с амилазой слюны, рН-оптимум которой равен 6,8.

Ход работы. В три пробирки внести по 3 мл буферного раствора с рН 1,2; 6,8 и 10,0. Добавить в каждую пробирку по 1 мл слюны, разведенной водой в 10 раз, и по 2 мл 0,5%-ного раствора крахмала. Смешать и инкубировать при 37⁰С 10 мин. Подкислить содержимое второй и третьей пробирок добавлением соответственно 1 и 2 мл 0,1 н соляной кислоты (реакция на крахмал положительна только в кислой среде!) и провести пробу Люголя. Сравнить интенсивность распада крахмала в зависимости от рН и сделать выводы.

3. Специфичность действия ферментов. Специфическими субстратами амилазы слюны являются крахмал и гликоген, расщепление которых амилаза катализирует. Образующаяся при расщеплении крахмала мальтоза обнаруживается пробой Троммера.

Используя в качестве субстрата сахарозу, можно убедиться в том, что амилаза не катализирует распад крахмала.

Ход работы. В одну пробирку внести 2 мл 0,5%-ного раствора крахмала, в другую -.2 мл 2%-ного раствора сахарозы. Добавить в обе пробирки по 2 мл слюны, разведенной в 10 раз водой, смешать и оставить на 10 мин при 37⁰С.

Провести с содержимым обеих пробирок пробу Троммера. Она окажется положительной при наличии редуцирующего углевода - мальтозы (пробирка первая) и отрицательной в отсутствие редуцирующего углевода (пробирка вторая).

Решите следующие задачи, приведите ход рассуждений:

1. Как доказать, что способность дрожжевых клеток расщеплять крах­мал сохраняется и при их разрушении?

Вы располагаете раствором крахмала, раст­вором Люголя, поваренной солью и льдом.

2. Как обнаружить присутствие каталазы в биологической жидкости?

3. Какой раствор можно использовать для обнаружения примеси свежей крови в воде: разбавленным этанолом, муравьиной кислотой, перекисью водорода, раствором хлорида калия?

4. Выберите правильное утверждение:

а) катализатор ускоряет реакцию, не участвуя в ней;

б) катализатор ускоряет реакцию, образуя промежуточные соединения с исходными продуктами, и входит в состав конечных продуктов;

в) катализатор ускоряет реакцию, взаимодействуя с реагирующими соединениями, но не входит в состав конечных продуктов;

г) катализатор ускоряет реакцию, но не входит в состав конечных продуктов.

5. Вещества А и Б взаимодействуют по схеме А+Б↔АБ. При заданной концентрации А и Б через 30 мин после их смешивания устанавливается подвижное равновесие - скорость прямой и обратной реакций уравниваются.

Какую из приведенных характеристик реакции изменит внесение катализатора?

6. Вещество х,не изменяет соотношения между концентрацией исходных и конечных продуктов реакции в состоянии подвижного равновесия, но удлиняет (или сокращает) время наступления равновесия.

В каком случае это вещество можно назвать катализатором?

7. Скорость взаимодействия А+Б увеличилась в 3 раза после добавления вещества К. В качестве конечных продуктов в последнем случае обнаруживаются соединения АК и БК. Является ли вещество К катализатором?