Лабораторная работа (Оксидоредуктазы)

Обнаружение тирозиназы в картофеле. Фермент тирозиназа (или согласно классификации моноамин: О_2-оксидоредуктаза дезаминирующая) содержится в тканях растений и животных, относится к числу медьсодержащих белков, катализирует, как следует из рационального названия, окислительное дезаминирование моноаминов согласно реакции:

О₂+Моноамин + Н₂О→Альдегид +Аммиак + Н₂О₂.

В организме тирозиназа катализирует превращение адреналина в адренохром - бурый пигмент.

Ход работы. Примерно 1 г картофеля измельчить скальпелем и растереть в ступке с 3 мл дистиллированной воды. Гомогенат фильтровать через двойной слой марли - в фильтрате содержится тирозиназа.

В две пробирки внести по 1 мл фильтрата. Содержимое одной пробирки нагреть до кипения и поддерживать кипение 2 мин (инактивация фермента). В обе пробирки внести по 5 капель 0,1%-ного раствора адреналина, смешать и инкубировать при 40⁰С, периодически встряхивая и наблюдая за изменением окраски.

Жидкость в пробирке с активным (не подвергшимся нагреванию) фильт­ратом розовеет, затем принимает бурую и темную окраску. Это связано с окислительным дезаминированием, приводящим к образованию пигментов. В пробирке, где фермент инактивирован кипячением, изменение окраски не наблюдается, т. е. адреналин не подвергается превращениям.

 

Аргументировано и кратко ответить на следующее:

1. Может ли осуществиться окисление СН_З - СН₂ - СН₂ - ОН в СН₃ - СН₂-СН=О в бескислородной среде? Какие условия для этого необходимы? Написать схему реакции.

2. Может ли и при каком условии в бескислородной среде произойти окисление по типу СН₃ - СН₂ - СН=О → СН₃ - СН₂ - СООН? Укажите необходимые компоненты, составьте схему реакции.

3. Является ли кислород исключительным (единственным) конечным акцептором водорода в цепи тканевого дыхания и вообще в биологическом окислении? Почему эволюция «избрала» кислород в качестве конечного акцептора водорода?

4. Реакция СН₃ - СН =О → СН₃ - СООН осуществлена в бескислородной среде. Как объяснить появление двух атомов кислорода в продукте реакции, в то время как исходный продукт содержит только один атом кислорода?

5. Какие компоненты, необходимые для осуществления изображенной ниже реакции, отсутствуют в схеме?

СООН - СН_2-- СН₂ – СООН + 1/2О₂ → СООН - СН = СН - СООН+Н₂О.

5. Почему окисление в живой природе отождествляли с горением?

6. Описать внешние признаки сходства между горением и процессом окисления в организме.

7. Где в организме осуществляется потребление кислорода?

8. Назвать предпосылки, обусловившие появление теории активации водорода.

9. Сформулировать понятие «дегидрирование», определить роль кислорода и воды в биологическом окислении, протекающем как процесс дегидрирования.

10. Функция кислорода в дегидрировании (определить с помощью трёх слов).

11. Сформулировать современное положение о биологическом окислении, назвать его виды.

12. Свободнорадикальное окисление в клетке, активные формы кислорода, как ограничивается интенсивность процесса.

ЗАНЯТИЕ 8 («Тканевое дыхание, локализация

И участники процесса»)

Цель: ознакомиться с важнейшим механизмом биологического окисления – тканевым дыханием, структурой и локализацией ферментов этого процесса, с механизмами транспорта протонов и электронов по дыхательной цепи, фактором, определяющим направление переноса.

Студент должен знать:

1. В какой роли выступает в процессе тканевого дыхания окисляемый субстрат.

2. Что представляют собой акцепторы-донаторы протонов и электронов в дыхательной цепи, их структуру, последовательность взаимодействия,

3. Чем определяется направление транспорта протонов-электронов; компоненты структуры простетических групп дегидрогеназ, определяющие их способность транспортировать электроны и протоны.

4. Водородтранспортный и электронтранспортный участки дыхательной цепи, множественность форм электронтранспортных компонентов, чем отличаются неаутооксидабельные и аутооксидабельные компоненты.

5. Локализацию энзимов тканевого дыхания, последовательность их расположения во внутренней мембране митохондрии.

6. О свойстве внутренней мембраны относительно Н-ионов, структуру и роль протонного канала.

7. Значение некоторых витаминов в транспорте протонов и электронов.

8. Отличия в механизмах дегидрирования насыщенных, ненасыщенных соединений, спиртов, альдегидов, кетонов и аминокислот.

 

. Студент должен уметь:

1. о ведущей роли биологического окисления в поддержании энергетического обмена,

2. Опознать по структуре кофермента дегидрогеназ их место в дыхательной цепи.

3. Составить схему локализации и функционирования дыхательной цепи.

4. Изобразить схему того структурного компонента митохондрий, в котором располагаются энзимы дыхательной цепи, указать на схеме элементы протонного канала

5. Уметь изображать структурные формулы важнейших макроэргических соединений живой природы.

6. Показать на фрагментах структурных формул насыщенных и ненасыщенных соединений, спиртов, альдегидов и кетонов ход их дегидрирования.

Студент должен получить представление:

1) о значении нарушений биологического окисления в развитии некоторых патологических состояний,

3) о патологических состояниях, ведущих к нарушению энергетического обмена..

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения т емы:

1) основные положения термодинамики,

2) представления об окислительно-вос­ста­новительном потенциале,

3) о принципах определения окислительно-восстановительного потенциала in vitro.

 

Аудиторная работа.

Лабораторная работа (сопоставление окислительно-восстанови­тель­ного потенциала рибофлавина и метиленовой сини).

Ход работы. В пробирку внести 4 - 5 капель воды, одну каплю взвеси рибофлавина и по каплям добавлять раствор красителя «метиленовый синий» до появления синего или зеленовато-синего окрашивания раствора. Затем внес­ти в пробирку гранулу цинка и 2 капли концентрированной соляной кислоты. Начинается выделение пузырьков водорода. По мере насыщения раствора водородом окислительно-восстановительный потенциал смеси постепенно снижается, и происходит восстановление рибофлавина и метиленового синего. Восстановление всего имеющегося метиленового синего (Е - 0,11) происходит раньше, чем восстановление значительной части рибофлавина (Е - 0,20), поэтому окраска жидкости переходит последовательно в зеленый, желто-зеленый, желтый и, наконец, бледно-желтый или розовый цвет.

Бледно-желтую жидкость слить в другую пробирку и наблюдать изменение окраски. Водород в жидкость больше не поступает, а ранее растворенный в ней водород частично уходит в атмосферный воздух, отчасти переносится через рибофлавин и метиленовый синий на кислород воздуха. В связи с этим окислительно-восстано­ви­тель­ный потенциал, постепенно повышается. После расходования водорода в растворе начинается окисление восстановленного рибофлавина, он передает водород через метиленовый синий на кислород и приобретает желтую окраску (раствор желтеет). Затем начинается окисление восстановленного (т.е. бесцветного) метиленового синего - раствор становится вначале зеленым, а затем синим.

В протоколе работы записать схему переноса водорода в изучаемой системе.

Дать (приводя ход решения) ответы на следующие задачи

или выполнить указанные действия:

1. Соединения А, В, С, Х и Y имеют редокс-потенциалы, равные - 0,39, + 0,22, - 0,37, - 0,35, + 0,28 В соответственно.

В какой последовательности будет происходить перенос электронов в системе, включающей эти соединения (от водородного электрода)?

2. Написать реакции дегидрирования соединений:

а) R-СН₂-СН₂-R; б) R-СН=О; в) R-СНОН-R; г) R-СН=СН-R.

3. Какие из перечисленных соединений являются субстратом флавиновых ферментов: глюкоза, сахароза, янтарная кислота, глицериновый альдегид, НАД Н⁺, НАДФ Н⁺, глутаминовая кислота?

4. Какие из перечисленных соединений могут служить акцепторами водорода от флавиновых ферментов: О₂, НАД, НАДФ, цитохромы, пировиноградная кислота, глутатион, фумаровая кислота?

5. Как изменится коэффициент полезного действия (КПД) тканевого дыхания, сопряженного с окислительным фосфорилированием, если в переносе протонов и электронов не участвуют НАД-дегидрогеназы (КПД в условия нормы принять равным 0,4)?

6. Как изменится теплопродукция органа; если при постоянной интенсивности тканевого дыхания в связи с появлением разобщающего фактора коэффициент Р/О снизился с 3 до 1?

 

7. Какой элемент отсутствует в уравнении:

СOOH-СН₂-СН₂-COOH +? →^{сукцинатдегидрогеназа}→ СООН-CH=CH-СООН +?

 

8. Какие элементы отсутствуют в уравнениях:

 

а) Н₂СО +? →? + НСООН;

б)? + 1/2О₂ ^{ксантиноксидаза} > НСООН +?

 

9. Напишите химическое уравнение реакции анаэробного дегидрирования первичного спирта с учетом всех необходимых компонентов.

10. Три названных ниже продукта могут составить окислительно-вос­ста­но­вительную цепь: 0₂, глутаминовая кислота, протеин-ФМН.

Построить цепь в последовательности: донатор - промежуточный акцептор протонов и электронов - конечный акцептор.

11. Как изменится теплопродукция органа, если блокирована НАД-деги­дро­геназа, но сохранена функция, других компонентов дыхательной цепи? В качестве субстрата используется глутаминовая кислота (до повреждения орган продуцировал 50 кал/мин).

12. Коэффициент Р/О исследуемой ткани снизился с 3 до 2 (с 3 до 1).

Какой процесс, на каких этапах нарушен в первом и втором случаях?

13. В пробирке создана система, содержащая неповрежденные митохондрии, обеспечивается доступ кислорода, присутствуют достаточные количества АДФ и неорганического фосфата.

Подберите из перечисленных ниже субстратов такие, окисление которых может обеспечить коэффициент Р/О, равный.2 или 3: глюкоза, глицериновый альдегид, глутаминовая кислота, НАД Н⁺, НАДФ Н⁺, янтарная кислота.

14. Как изменится концентрация неорганического фосфата и АДФ в системе, содержащей неповрежденные митохондрии и обильно снабжаемой способным к окислению субстратом: 1) в присутствии 2,4-динитрофенола, 2) в отсутствие 2,4-динитрофенола.

Аргументировать ответ

Занятие 9 (итоговое).

При подготовке к занятию в порядке самоконтроля определить с помощью следующих вопросов, усвоены ли Вами разделы «Ферменты» и «Биологическое окисление» (использовать материалы лекций, учебники).

1. Природа и свойства ферментов.

2. Номенклатура и классификация ферментов.

3. Принципы определения и выражения активности ферментов.

4. Кинетика ферментативных процессов; эффекторы ферментативных реакций (ингибиторы и активаторы);

8. Современные представления о биологическом окислении (тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование).

9. Ферменты тканевого дыхания – локализация, последовательность размещения, понятия «донатор-акцептор» протонов и электронов, водород- и эелектронтранспортные участки, конечный акцептор электронов и протонов

10. Типы дегидрирования.

11. Механизмы сопряжения и разобщения (фактор сопряжения, разобщающие факторы, коэффициент Р/О).