Хроматографические колонки и детекторы

Колонки. В газо-адсорбционной хроматографии колонки заполняются твердым сорбентом. Адсорбция газа на твердом сорбенте подчиняется уравнению изотермы адсорбции (5). Строение и свойства сорбентов весьма многообразны. По классификации Киселева к первому типу относятся неспецифические сорбенты, не имеющие на поверхности каких-либо функциональных групп (например, угли), ко второму типу принадлежат сорбенты, имеющие на поверхности заряды (например, гидроксидные группы силикагеля), и к третьему – адсорбенты, имеющие на поверхности связи или группы атомов с сосредоточенной электронной плотностью (например, полимеры с нитрильными группами).

Возможности хроматографического определения вещества в газовой фазе значительно возросли с открытием в 1952 г. метода газо-жидкостной хроматографии. При анализе по этому методу анализируемая газовая смесь проходит через колонку, наполненную твердым носителем, на поверхность которого нанесен тонкий слой жидкой фазы. Таким образом, с компонентами пробы здесь взаимодействует уже вещество жидкой пленки, хотя в реальных условиях газо–жидкостной хроматографии компоненты смеси частично взаимодействуют и с твердым адсорбентом.

Эффективность разделения в газо-жидкостной хроматографии зависит главным образом от правильности выбора жидкостной фазы. Строго обоснованных теоретических способов выбора жидкой фазы не существует в связи со сложностью протекающих процессов и недостаточной разработанностью теории растворов. Однако требования к жидкой фазе предъявляются совершенно определенные. Жидкая фаза должна обладать достаточно высокой селективностью, т.е. способностью разделять смеси компонентов, быть химически инертной по отношению к компонентам смеси и к твердому носителю, оставаться термически устойчивой, не растворять газ-носитель, иметь малую вязкость и быть нелетучей (или иметь летучесть незначительную).

При выборе жидкой фазы полезным оказалось старое правило – «подобное растворяется в подобном». В соответствии с этим правилом для разделения смеси двух веществ выбирают жидкую фазу, близкую по химической природе одному из компонентов. Ограниченность такого подхода для веществ с близкими свойствами или смесями сложного состава очевидна.

В качестве жидкой фазы в газо-жидкостной хроматографии используют вазелиновое масло, силиконовое масло, фталаты (дибутил, диоктил и др.), диметилформамид, трикрезилфосфат и др.

В качестве твердых носителей применяют инертные вещества с развитой поверхностью, но малой микропористостью, чтобы по возможности исключить адсорбцию газа на поверхности. Наибольшее распространение получили носители на основе кизельгура или диатомита. Применяют также стеклянные микрошарики. Для разделения реакционноспособных веществ используется тефлон.

Существенно повышается эффективность разделения в капиллярной хроматографии. Название метода связано с тем, что в качестве хроматографической колонки используется капилляр с внутренним диаметром 0,1÷0,5 мм и длиной в несколько десятков метров. Жидкая фаза наносится непосредственно на стенку этого капилляра, которая в данном случае играет роль носителя. В капиллярной колонке существенно уменьшается сопротивление потоку газа, поэтому появляется возможность увеличить длину колонки и повысить таким образом эффективность разделения. Значительно уменьшается в капиллярной хроматографии объем пробы для анализа и сокращается длительность анализа: метод становится близким к экспрессному.

Детекторы. Одним из наиболее распространенных дифференциальных детекторов является катарометр. Принцип его работы основан на измерении сопротивления нагретой платиновой или вольфрамовой нити, которое зависит от теплопроводности омывающего газа. Количество теплоты, отводимое от нагретой нити, при постоянных условиях зависит от состава газа. Чем больше теплопроводность определяемых компонентов смеси будет отличаться от теплопроводности газа - носителя, тем большей чувствительностью будет обладать катарометр. Наиболее подходящим газом – носителем с этой точки зрения является водород, теплопроводность которого значительно превышает соответствующую характеристику большинства других газов. Однако в целях техники безопасности чаще применяется гелий, теплопроводность которого также достаточно высока.

Принцип действия пламенного детектора основан на том, что температура водородного пламени горелки изменяется при попадании в него органических веществ. Наибольшей чувствительностью обладают ионизационные детекторы, например, пламенно - ионизационный (ПИД), позволяющие обнаруживать до 10^{-12 г. В этих детекторах измеряют электрическую проводимость пламени водородной горелки. Чисто водородное пламя обладает очень низкой электрической проводимостью. При появлении в водороде примесей органических соединений происходит ионизация пламени, пропорциональная концентрации примеси, что легко может быть измерено. Высокая чувствительность детекторов этого типа обусловила их широкое применение. Однако высокая чувствительность ПИД проявляется по отношению только к органическим соединениям, а к неорганическим, таким, как аммиак, сероводород, оксиды серы, кислород, азот и т.д., чувствительность детектора резко падает.}

Известны и другие типы детекторов: ультразвуковые, диафрагменные, микрокулонометрические и т.д. Для проведения количественных расчетов детектор обычно градуируется.

Качественный анализ

Хроматографический качественный анализ основан на использовании характеристик удерживания – времени удерживания или пропорционального ему удерживаемого объема и индексов удерживания. Для этой цели применяются относительные удерживаемые объемы [см. формулу (10)], которые в значительно меньшей степени, чем абсолютные величины, подвержены действию случайных факторов. Идентификация исследуемых веществ производится сравнением полученных и табличных данных. Условия опыта, естественно, не должны отличаться от тех, в которых были получены табличные данные.

Рис.17. Хроматограммы смеси воды и кислот (115^о С):

1 – вода; 2 – муравьиная кислота; 3 – уксусная кислота; 4 – пропионовая кислота; 5 – изомасляная кислота; 6 – н – масляная кислота; 7 – изовалериановая к-та

Количественный анализ

Количественный хроматографический анализ основан на измерении различных параметров пика, зависящих от концентрации хроматографируемых веществ – высоты, ширины, площади и удерживаемого объема – или произведения удерживаемого объема на высоту пика. При достаточной стабильности условий хроматографирования и детектирования определяющим параметром пика можно считать его высоту.

Основными в количественной хроматографии являются методы: нормировки, нормировки с калибровочным коэффициентами, внутренней стандартизации и абсолютной калибровки.

При использовании метода нормировки принимают сумму каких-либо параметров пиков, например сумму высот всех пиков или сумму их площадей, за 100%. Тогда отношение высоты отдельного пика к сумме высот или отношение площади одного пика к сумме площадей, умноженное на 100, будет характеризовать массовую долю (%) компонента в смеси. Вполне понятно, что такой метод предполагает существование одинаковой зависимости величины измеряемого параметра от концентрации для всех компонентов смеси.

В методе нормировки с калибровочными (градуировочными) коэффициентами за 100% принимается сумма параметров пиков с учетом чувствительности детектора. Различие в чувствительности детектора учитывается с помощью поправочных коэффициентов для каждого компонента. Один из преобладающих компонентов смеси считают сравнительным и поправочный коэффициент для него принимают равным единице. Калибровочные (градуировочные) коэффициенты К рассчитывают по формуле:

К_i =

где П_ст – параметр пика (высота, площадь и т.д.) стандартного вещества;

П_i – параметр пика определяемого компонента.

За 100% принимается сумма исправленных параметров К_iП_i и результат анализа рассчитывается также, как и в методе нормировки.

Наиболее точным является метод абсолютной калибровки. В этом методе экспериментально определяют зависимость высоты или площади пика от концентрации вещества и строят градуировочные графики. Далее определяют те же характеристики пиков в анализируемой смеси и по градуировочному графику находят концентрацию анализируемого вещества. Этот простой и точный метод является основным методом определения микропримесей. Кроме того, метод не требует разделения всех компонентов смеси, а ограничивается лишь теми, определение которых необходимо в данном конкретном случае.

Метод внутреннего стандарта основан на введении в анализируемую смесь точно известного количества стандартного вещества. В качестве стандартного выбирают вещество, близкое по физико-химическим свойствам к компонентам смеси, но не обязательно являющееся ее компонентом. После хроматографирования измеряют параметры пиков анализируемого компонента и стандартного вещества. Если стандартное вещество не входит в состав анализируемой смеси, массовую долю компонента (%) рассчитывают по формуле

ω_i = ,

где Q_i и Q_ст – параметры пиков анализируемого компонента и стандарта соответственно;

r – отношение массы внутреннего стандарта к массе пробы.

Практическое применение

Широкое применение и большое значение газовой хроматографии в практике вызвано тем, что с ее помощью можно идентифицировать отдельные компоненты сложных газовых смесей и определять их количественно, выполнение анализа не требует больших затрат времени, и метод является достаточно универсальным. Эффективно используется газовая хроматография в препаративных целях, в физико–химических исследованиях и других областях.

Методом газовой хроматографии анализируют пищевые продукты и продовольственное сырье, нефтяные и рудничные газы, воздух, продукцию основной химии и промышленности органического синтеза, нефть и продукты ее переработки, многочисленные металлорганические соединения и т.д. Методы газовой хроматографии пригодны для разделения изотопов некоторых элементов, например водорода. Хроматография газов используется в биологии и медицине, в технологии переработки древесины, в лесохимии и пищевой промышленности, в технологии некоторых высокотемпературных процессов и многих других. Газовая хроматография может быть применена для анализа жидкостей после перевода их в пар в условиях работы хроматографической колонки.

Аналитическая реакционная газовая хроматография применяется для анализа сложных многокомпонентных смесей, определения микропримесей, анализа нелетучих соединений (например, различных полимеров), для элементного анализа и т.д.

Тонкослойная хроматография

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), получивший в настоящее время широкое распространение, был разработан Н.А.Измайловым и М.С.Шрайбер еще в 1938 г.

В методе ТСХ неподвижная твердая фаза тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинку. В 2÷3 см от края пластинки на стартовую линию вносят пробу анализируемой жидкости и край пластинки погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза жидкостной адсорбционной хроматографии. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. Диффузия в тонком слое происходит в продольном и поперечном направлениях, поэтому процесс следует рассматривать как двумерный.

Основные характеристики ТСХ

Схема ТСХ и экспериментально определяемые величины, которые характеризуют этот процесс, приведены на рис.18.

Сорбционные свойства системы в ТСХ характеризуются подвижностью R_f, которая рассчитывается из экспериментальных данных (рис.16) по уравнению:

R_f, = , (13)

где Х₁ – расстояние от стартовой линии до центра зоны;

Х_f – расстояние, пройденное за то же время растворителем.

Строго говоря, при определении подвижности вместо расстояний Х₁ и Х_f следовало бы учитывать скорость движения соответствующих веществ в тонком слое, так как в теории ТСХ принято считать, что скорость движения центра зоны хроматографируемого вещества составляет строго определенную долю скорости движения растворителя. Однако измерение этих величин затруднительно, а значения R_f, рассчитанные по соотношению (13), так же характеризуют подвижность. По смыслу определения R_f как свойство, характерное для данной системы, не должно зависеть от концентрации и других факторов. Опыт показывает, однако, что воспроизводимость и постоянство значений R_f не всегда достаточны, особенно при анализе неорганических ионов. На R_f влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителя и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю. На практике часто пользуются относительной величиной:

R_{f, отн} = ,

где R_f,ст ‑ так же рассчитывается по уравнению (13).

Стандартное вещество (свидетель) в том же растворителе наносится на стартовую линию рядом с анализируемой пробой и, таким образом, хроматографируется в тех же условиях.

Рис.18. ТСХ – схема: а–а – стартовая линия; b–b – граница фронта
растворителя в конце опыта; заштрихованные пятна характеризуют
положение компонентов в тонком слое в конце опыта

Теоретический анализ показывает, что при небольших значениях R_f и уменьшении длительности анализа размывание зоны вещества на сорбенте бывает максимальным, следовательно, концентрация вещества будет максимальна и чувствительность анализа увеличится. Уменьшение диаметра зерна в тонком слое приводит к увеличению продолжительности анализа и усиливает диффузное размывание.

Основные элементы установок ТСХ

Подложки для сорбента (пластинки) обычно изготавливают из стекла, алюминиевой фольги или полиэфирной пленки. Одно из достоинств пленки состоит в том, что она прозрачна примерно до 320 нм и это позволяет проводить прямое фотометрирование многих веществ непосредственно в слое.

Сорбент может быть нанесен на подложку в виде пасты (закрепленный слой), тонкого порошка (незакрепленный слой) или быть приготовленным при обжиге силикагеля на стеклянной пластине.

В качестве сорбента в ТСХ применяют силикагели, оксид алюминия, крахмал, целлюлозу и некоторые другие вещества с высокой адсорбционной способностью. Для характеристики сорбционной активности оксида алюминия часто используется шкала Брокмана, составленная по R_f стандартного набора красителей. Эффективно применяются в ТСХ в качестве сорбентов жидкие иониты и другие вещества, обладающие ионообменными свойствами и свойствами молекулярных сит (например, сефадексы). Выбор растворителя зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Например, при хроматографировании аминокислот используют смесь н – бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов – водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН.

В восходящей хроматографии растворитель поднимается снизу вверх под действием капиллярных сил, в нисходящей – растворитель передвигается по слою вниз под действием и капиллярных и гравитационных сил. Горизонтальная хроматография выполняется в виде круговой и со свободным испарением растворителя. В круговой хроматографии в центр горизонтально установленной пластинки вносят каплю анализируемой смеси и непрерывно подают растворитель, который под действием капиллярных сил движется в радиальном направлении от центра. Компоненты смеси располагаются в слое в виде концентрических колец.

По окончании хроматографирования непроточным методом зоны на хроматограмме проявляют химическим или физическим способом. При химическом способе пластинку опрыскивают раствором реактива, взаимодействующего с компонентами смеси. При обработке, например, парами йода четко проявляются непредельные соединения. В физических способах проявления используется способность некоторых веществ флуоресцировать под действием ультрафиолетового излучения, часто при добавлении флуоресцирующего индикатора, взаимодействующего с компонентами смеси. Вещества, обладающие радиоактивным излучением, обнаруживаются методом радиоавтографии с помощью различных фотоматериалов (бумаги или пленки). После проявления хроматограммы приступают к идентификации веществ и дальнейшему анализу.

Качественный анализ

Проще всего идентификация вещества может быть сделана, если пятно определяемого вещества имеет характерную окраску или определяемое вещество образует на хроматограмме окрашенное пятно под действием специального реактива. Однако число таких веществ, особенно органических, невелико, поэтому метод имеет ограниченное применение.

Наиболее общий подход к качественному анализу основан на значениях R_f. Хроматографическая подвижность является чувствительной характеристикой вещества, однако она существенно зависит от условий определения. Эта трудность преодолевается путем опыта в строго фиксированных стандартных условиях, которые регламентируют размер пластин, толщину слоя сорбента, объем пробы, длину пути фронта растворителя и другие факторы. При соблюдении стандартных условий получаются воспроизводимые значения R_f, которые можно использовать в аналитических целях при сравнении с табличными, если они получены в тех же условиях опыта.

Самым надежным является метод свидетелей, когда на стартовую линию рядом с пробой наносятся индивидуальные вещества, соответствующие предполагаемым компонентам смеси. Влияние различных факторов на все вещества будет одинаковым, поэтому совпадение R_f компонента пробы и одного из свидетелей дает основания для отождествления веществ с учетом возможных наложений. Несовпадение R_f интерпретируется более однозначно: оно указывает на отсутствие в пробе соответствующего компонента.

Количественный анализ

Количественные определения в ТСХ могут быть сделаны или непосредственно на пластинке, или после удаления вещества с пластинки. При непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным методом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества.

Применяют также прямое спектрофотометрирование пластинки с помощью спектроденситометров. Для количественных расчетов также предварительно строят градировочный график, используя оптическую плотность в центре пятна.

В настоящее время ТСХ является одним из важных методов аналитической химии. Это непревзойденный метод анализа сложных смесей. Он прост по методике выполнения и аппаратуре, экспрессен, не требует для анализа больших количеств веществ.