Рідинна колонкова хроматографія.

В класичному варіанті рідинної колонкової хроматографії через хроматографічну колонку, що являє собою скляну трубку, діаметром 0,5-5 см і довжиною 20-100 см, заповнену сорбентом (НФ), пропускають елюєнт (РФ).

Елюєнтом найчастіше є суміш розчинників, або один розчинник, який рухається під дією сили тяжіння. Швидкість регулюється краном внизу колонки. Пробу досліджуваної речовини поміщають у верхню частину колонки. По мірі просування проби по колонці проходить розділення компонентів. Через певні проміжки часу відбирають фракції елюєнту, які піддаються аналізу.

Склад і швидкість подачі елюєнту може мінятися лінійно, експоненційно чи якось інакше, залежно від умов. Для підвищення швидкості створюють тиск до 40 МПа. Проба вводиться через інжектор, безпосередньо в потік елюенту, після проходження через колонку речовини детектуються високочутливим детектором, сигнал якого обробляється мікро-ЕВМ. При необхідності в момент виходу піку відбираються фракції.

Колонка являє собою трубку з нержавіючої сталі з внутрішнім діаметром 2-6 мм; довжиною 10-25 см відполірованою всередині. Колонка заповнюється частинками сорбенту розміром 3,5-10 мкм, звичайно сферичної форми. Заповнення проводять прокачуючи суспензію сорбенту в спеціально підібраному розчиннику під тиском 50-80 МПа. Такі колонки мають високу роздільну здатність (40-150 тисяч теоретичних тарілок на 1 м) в сотні раз перевищують аналогічні відкриті колонки.

Детектори. Як детектори використовують високочутливі спектрофотометри, які дозволяють виявляти до 10^-10 М сполук, які поглинають в УФ чи видимій області спектра (190 – 800 нм). Для незабарвлених речовин можна використовувати диференціальний рефрактометр. При аналізі сполук, які здатні до окислення чи відновлення застосовують електрохімічний детектор, який є мініатюрним полярографом. Використовуються флюоресцентні детектори і детектори по електропровідності.

Нерухомі фази(НФ) – це речовини, які не повинні змішуватись з рухомими фазами (РФ), повинні бути механічно і хімічно стійкі і в умовах аналізу забезпечувати потрібну селективність і ефективність.

Найбільше поширені НФ:

Силікагель – гель кремнієвої кислоти з загальною формулою SiO2·Н2О. Це специфічний адсорбент. Адсорбція проходить внаслідок утворення водневих зв’язків речовини, що адсорбується з поверхневими силанольними групами º Sі–ОН. Для хроматографії використовується силікагель з площею поверхні 100 – 700 м²/г. Поверхня має слабокислий характер (рН =3 – 5). Основні речовини сорбуються на силікагелі краще, ніж на основних сорбентах. Використовується для розділення різних класів сполук: вуглеводнів, органічних кислот, амінів і ін.

Оксид алюмінію. Поверхня цього сорбенту, створена йонами Аl³⁺ і О^{2 -} здатна створювати сильне електростатичне поле, що має поляризуючі властивості. На Аl2О3 сорбуються сполуки, які мають систему легко зміщуваних електронів (ненасичені, ароматичні і ін.).

Модифіковані сорбенти. Набули широкого застосування, коли прививають різні групи до основної маси адсорбенту:

ºSi – O – Si – (CH2)7 – CH3 ºSi – O – Si – (CH2)17 – CH3

 

ºSi – O – Si(- CH2)₇ – С₆Н₅ ºSi – O – Si – (CH2)3 – NH2

Такій модифікації піддають силікагель. Силанольні групи заміняють на різні органічні сполуки, які змінюють селективність.

Йонообмінна хроматографія.

В основі лежить процес йонного обміну

_рА + В_і А_і + В_р

р – до розчинника

і – до йонообмінника

Розділення в йонообмінній хроматографії грунтується на різниці спорідненості аналізованих йонів до йонів протилежного знаку, жорстко закріплених в йонообміннику. Такі йони називають фіксованими, а йони що компенсують їх заряд – протийонами, які входять в склад рухомої фази.

При хроматографії йон А, який входить в колонку, буде обмінюватись згідно рівняння обміну з рухомим протийоном йоніоніту В. Оскільки йонний обмін проходить при безперервному русі елюенту, що містить В, рівновага буде зсуватись в бік десорбції йону А. Він буде заміщатись на йон В, який поступає з розчину. Почнеться обернена реакція. За цей час зона проби посунеться на колонці. Зона йонів з великою спорідненістю до фіксованих йонів протилежного знаку буде відставати від зони йонів з меншою спорідненістю.

Нерухомою фазою є мінеральні матеріали: цеоліти, глинисті матеріали (каолін, монтморилоніт, слюди і інші), синтетичні неорганічні йоніти і спеціально приготоване сульфоване вугілля.

Тонкошарова хроматографія

Тонкошарова хроматографія (ТШХ) – вид хроматографії, в якій розділення забезпечуєтьсяпереміщенням рухомої фази (РФ) через нанесений на поверхню тонкий шар сорбенту. Рух по пластинці забезпечується капілярними силами.

Є кілька видів ТШХ, які відрізняються способом подачі розчинника. Найбільш поширена є (висхідна) хроматографія. Для її здійснення елюєнт наливають на дно камери, а нижній край пластинки з нанесеними пробами поміщають в розчинник, який підіймаючись по пластинці знизу вверх, розділяє при цьому компоненти суміші, які слабо рухаються по шару.

Для нисхідної хроматографії розчинник подають зверху. При цьому до капілярних сил додаються ще й сили гравітації. Тут розділення проходить швидше.

Досить ефективною є радіальна хроматографія, для якої пробу наносять в центр пластини і знизу за допомогою фітиля подають елюєнт, який розносить пробу у всіх напрямках. При цьому хроматограма має вид концентричних кіл, кожне із яких відповідає окремому компоненту.

Хроматограми мають вид.

висхідна нисхідна

хроматографія хроматографія

 

 

радіальна

хроматографія

В залежності від режиму подання елюєнта, розрізняють ТШХ безперервного, багаторазового, ступінчатого, градієнтного і двохмірного хроматографування.

При безперервному хроматографуванні розчинник постійно подається на пластину, а досягнувши кінця шару, або випаровується, або поглинається паперовим фільтром. Для покращення розділення компонентів суміші можна багатократно повторяти одним і тим же розчинником, висушуючи пластину перед кожним послідуючим хроматографуванням. Ступінчате хроматографування проводять різними розчинниками так, що новий розчинник піднімається по пластинці вище рівня попереднього. Якщо компоненти суміші забарвлені, то їх можна побачити візуально.

Незабарвлені суміші необхідно проявляти. При цьому в залежності від визна-чуваних речовин їх можна виявити:

1) в світлі УФ плями речовин можуть самі світитись, або гасити люмінісценцію, якщо пластинки оброблені люмінісціюючими речовинами (UV-250 Silufol).

2) в парах йоду – виявляються речовини, які мають подвійні зв’язки.

3) обприскування проводити спеціальними обприскувальними реагентами. Застосування реагента залежить від того, які речовини виявляють.

4) застосування свідків (точно відомих речовин) – є надійним методом виявлення компонентів.

Хроматографія на папері.

Механізм - розподільчий. Нерухомою фазою служить спеціальний хромато-графічний папір. Це один з видів фільтрувального паперу, який виконує як роль колонки, так і тонкого шару по якому суміш і елюєнти піднімаються за допомогою капілярних сил. Види цієї хроматографії такі як і в тонкошарової, виявлення - теж. Перевагами може служити доступність такого паперу, а також те, що одержану пляму можна вирізати і відділити від інших. Це можна використати в будь-якій лабораторії.

Двохмірною хроматографією називають такий спосіб, коли спочатку пропускають елюєнт в одному напрямку, а потім в іншому.

Для ТШХ використовують пластинки, з закріпленим шаром адсорбенту – силікагелем, або Al₂O₃.

Пластинку з нанесеними пробами поміщають в камеру для хроматографування. Камера – це посудина, що закривається. Важливе значення має атмосфера камери яка повинна бути насиченою парами розчинника. Елюєнт треба вибирати так, щоб розділення було оптимальним. Для цього в довідниках є, так звані, елюотропні ряди, в яких розчинники розміщені в порядку зростання розділяючої сили, а також їх здатності взаємодіяти з рухомою і нерухомою фазами. Такі ряди можна знайти в “Довіднику хіміка.”

Для оцінки ступеня затримування застосовують величину R_f, яка рівна відношенню довжини шляху речовини Х₁, до довжини шляху розчинника від лінії старту до лінії фронту X_фр:

Газова хроматографія (ГХ).

Назва її від того, що як рухома фаза використовується газ, який називають газом - носієм. Обов’язковою умовою є перевід речовин, які хроматографують в газову фазу.

Аналіз ГХ виконують на газовому хроматографі, який має таку принципову схему:

6 5 4 3 2 1

 

9 8 7

1 - балон з газом-носієм (найкраще Н₂, або Не, може бути N₂)

2 - дозатор в який має поступати проба.

Пробу вводять спеціальним шприцом і вона підхоплюється газом–носієм. При цьому вона повинна бути підігріта до такої температури, при якій проходить випаровування проби.

3 - колонка - найчастіше це стальна трубка з внутрішнім діаметром 3-6 см. Довжина 1-3 м у вигляді спіралі, яка проходить у термостаті. В колонці відбувається основна дія: проба ділиться на компоненти, які по черзі поступають в детектор.

4 - детектор, один із основних вузлів ГХ, адже він служить для безперервної фіксації залежності концентрації на виході із колонки від часу. Є різні види детекторів. Найбільш поширені: по теплопровідності, йонізації полум’я, електронному захопленню.

Принцип дії детектора по теплопровідності (катарометр) застосовується на зміні опору спіралевидної металічної нитки (вольфрам, платина), яка включена в плече так званого моста Уінстона, який вимірює її опір.

Зміна складу газової суміші приводить до зміни опору, що і фіксується детектором. Катарометр - простий і надійний в роботі, однак він має низьку чутливість і не визначає мікродомішок.

В детекторі з йонізації полум’я речовини, що виносяться газом- носієм попадають в полум’я водневого пальника. В результаті термічної дисоціації утворюються йони, концентрація яких прямо пропорційна кількості вуглецю, що входить в склад молекули. Цю концентрацію визначають вимірюючи провідність полум’я. Для цього в детекторі є анод і катод між якими накладають високу напругу (біля 300 В). Вимірювання йонного струму дозволяє виміряти до 1 нг (10^-9 г) вуглецю. Цей детектор чутливий лише до речовин, які йонізуються в полум’ї, тобто сполук, що містять С – С; С – Н зв’язки, і не чутливий до неорганічних сполук.

В детекторі по електронному захопленню газ-носій азот йонізується під дією частинок від радіоактивного джерела. Концентрацію визначають за допомогою системи електродів, яка фіксує зміну струму при попаданні речовин, які захоплюють вільні електрони. Такий детектор чутливий до речовин, які містять галогени, фосфор, металоорганічні сполуки. Тому їх використовують для визначення галогенів і фосфорвмісних пестицидів. Детектор теж находиться в термостаті при певній температурі.

5 – регістратор, фіксує сигнал детектора;

6 - обчислювальний інтегратор обробляє одержані дані.

В найсучасніших приладах є міні ЕВМ, яка видає інформацію в необхідній формі.

Етапи кількісного аналізу:

1). Відбір і обробка проб.

2). Введення проби в хроматографічну систему.

3). Хроматографування (саме розділення).

4). Реєстрація хроматограми.

5). Обробка хроматограми.

 

ЗАНЯТТЯ№15

Тема: Адсорбція на рухомій та нерухомій межі поділу фаз

Актуальність теми: Адсорбційні явища на твердих адсорбентах широко використовуються в медицині. Переважна більшість процесів у живому організмі проходить на межі поділу фаз і їх швидкість на ряду із іншими факторами визначається площею поверхні. При гемосорбції кров очищається від токсинів середньої молекулярної маси пропусканням її через адсорбенти – активоване вугілля різних марок, що широко використовується в реанімаційних відділеннях лікарень. Ентеросорбція є використання активованого вугілля для зв’язування токсинів в шлунково-кишковому тракті. Адсорбція органічних барвників на поверхні біологічних препаратів використовується в гістології.

Навчальні цілі:

Знати: механізми адсорбційних процесів на границі розділу фаз, теорію молекулярної адсорбції, кількісне визначення адсорбції.

Вміти: визначати адсорбцію оцтової кислоти активованим вугіллям і встановити залежність адсорбції від концентрації. Вивчити закономірності адсорбції на каоліні кислотних і основних барвників, а також залежність адсорбції від рН розчину.

Самостійна позааудиторна робота студентів.

1. Сорбційні процеси, їх різновиди.

2. Адсорбція на границі розділу тверда речовина- рідина, тверда речовина-газ, її механізм. Вплив різних факторів на ці процеси.

3. Привести приклади адсорбційної терапії.

4. Теорія молекулярної адсорбції Ленгмюра.

5. Кількісне визначення адсорбції. Рівняння Фрейндліха.

6. Особливості адсорбції з розчинів. Правило Ребіндера.

7. Адсорбція електролітів. Правило Панета – Фаянса.

8. Йонообмінна адсорбція. Йоніоніти. Їх використання в медико- біологічних дослідженнях

9. Хемосорбція. Вплив рН на процеси хемосорбції барвників білками.

Контрольні питання.

1. Що таке адсорбція, адсорбент, адсорбтив?

2. Теорія адсорбції Гіббса.

3. Ізотерма адсорбції Гіббса.

4. Приведіть приклади фізичної і хімічної адсорбції.

5. Рівняння адсорбції Ленгмюра.

6. Ізотерма адсорбції Ленгмюра.

7. Рівняння адсорбції Фрейндліха.

8. Теорія полімолекулярної адсорбції.

9. Правило Паннета-Фаянса.

10. Закономірності молекулярної адсорбції.

11. Особливості адсорбції на межі поділу тверде тіло – розчин.

12. Йонообмінна адсорбція.

13. Від яких факторів залежить адсорбція на межі поділу тверде тіло – розчин.

14. Згідно рівняння Ленгмюра знайти величину максимальної адсорбції, якщо при рівноважній концентрації 0,03 моль/л величина адсорбції 6^.10^-3 моль/м², а К=0,8.

15. Початкова концентрація розчину 0,44 моль/л після адсорбції розчиненої речовини із 60 см³ розчину активованим вугіллям масою 3 г концентрація знизилась до 0,350 моль/л. Обчислити величину адсорбції.