Непосредственное определение.

Микроскопия в темном поле.

Большинство бактерий не поддаются идентификации с помощью микроскопии; однако, некоторые микроорганизмы, например, лептоспиры, присутствующие в моче, можно увидеть при микроскопии в темном поле. К сожалению, это возможно только в течение 30 минут после выделения мочи, так как изменение рН быстро убивает микроорганизм. Кроме того, для определения лептоспир данным методом необходим некоторый опыт и подходящий микроскоп.

 

Гематологические и цитологические красители.

Бактерии можно окрашивать любыми красителями для крови и тканей. Чаще всего в лабораториях используют краситель Романовского (то есть модификация красителей Райта, Май-Грюнвальда-Гимзы и Лейшмана). Этот краситель окрашивает бактерии в темно-синий цвет и очень хорошо подходит для определения внутриклеточных бактерий или паразитов на поверхности эритроцитов (например, Haemobartonella felis) (см. рис. 5.8).

Некоторые практикующие врачи предпочитают использовать экспресс-красители, например, Diff-Quick®. Однако, они окрашивают эукариотические клетки в более темный синий цвет, чем обычные красители, поэтому нужно быть особенно внимательным при исследовании на внутриклеточные бактерии или паразитов, обитающих в эритроцитах. При экспресс-окраске большой проблемой является осаждение красителя. Образующийся при этом осадок можно легко принять за бактерии, особенно при недостаточном опыте.

 

Окраска по Граму.

Это основной способ, использующийся в бактериологии. Основан на реакции основного пара-розанилинового красителя (например, кристаллического фиолетового, метилового фиолетового или их смеси, так называемого генцианвиолета) с йодом. Продуктом этой реакции является нерастворимое соединение темно-красного цвета в клеточной стенке бактерий. Это вещество удаляется обесцвечивающими растворителями (такими, как ацетон или спирт). Степень обесцвечивания зависит от структуры и толщины клеточной стенки. Для демонстрации обесцвеченных микроорганизмов используют более светлый докрашивающий краситель. Грамположительные микроорганизмы устойчивы к обесцвечиванию и остаются темно-пурпурными. Эта устойчивость не постоянна, и при продолжительном обесцвечивании краситель все же смывается. Грамотрицательные микроорганизмы, как и весь цитологический препарат, окрашиваются в розовый цвет. В культурах и образцах, содержащих грамположительные микроорганизмы, может содержаться какое-то количество грамотрицательных клеток, особенно если образцы старые.

В литературе описано 4 различных схемы окраски по Граму. Ключевыми моментами являются только порядок добавления реагентов, время обесцвечивания и тщательное удаление всех реагентов (рис. 1.6). Существуют готовые наборы для окраски по Граму, к которым должна прилагаться инструкция от производителя.

 

Окраска по Цилю-Нильсену

Краситель Циля-Нильсена (ЦН) используется для определения кислотоустойчивых бактерий. Способ основан на способности клеточных стенок некоторых видов бактерий, окрашенных анилиновыми красителями (например, фуксином), сохранять окраску после обработки концентрированными кислотами. Такие клеточные стенки трудно поддаются окрашиванию; для того, чтобы краситель мог проникнуть внутрь, препарат обрабатывают фенолом в комбинации с нагреванием. Затем его докрашивают метиленовым синим для контрастирования с красной окраской кислотоустойчивых бактерий (рис. 1.7).

Метод окраски по ЦН имеет большое значение для определения микобактерий и некоторых штаммов Nocardia, которые трудно культивировать и которые потенциально зоонозны. Определение кислотоустойчивых микроорганизмов в цитологических мазках всегда важно.

 

Методика. 1. Зафиксируйте мазок, проведя его несколько раз над пламенем 2. Залейте мазок 0,5% метиловым фиолетовым или 1% кристаллическим фиолетовым и оставьте на 1 минуту 3. Смойте водой 4. Залейте мазок 1% йодным раствором люголя и оставьте на 1 минуту 5. Смойте водой 6. Залейте 95% спиртом и осторожно покачайте, пока краска не перестанет смываться с мазка. Это займет не менее 30 секунд. Если мазок очень толстый, можно добавить свежий спирт для ускорения обесцвечивания. 7. Промойте стекло однократно водой 8. Покрасьте мазок 0,5% основным фуксином в течение 30 секунд, 0,1% нейтральным красным в течение 2 минут, или 0,5% сафранином в течение 10 секунд. Примечания. · Для обесцвечивания можно использовать ацетон. Он действует быстрее, чем спирт (2 секунд бывает достаточно), но есть опасность слишком сильного обесцвечивания. · Ацетон более опасен при попадании на кожу или на одежду.   Подписи к фото: Грамположительные бактерии                           Грамотрицательные кокки

Рис. 1.6: окраска по Граму (с любезного разрешения д-ра Дэвида Тейлора)

Методика. 1. Залейте мазок 1% карболовым фуксином 2. Подогрейте стекло над пламенем, пока не пойдет пар 3. Периодически нагревайте стекло в течение 5 минут, чтобы оно оставалось горячим 4. Не позволяйте красителю высохнуть. При необходимости добавьте еще карболового фуксина 5. Смойте остатки красителя водой 6. Залейте стекло 20% серной кислотой и оставьте на 5 минут 7. Смойте водой 8. Повторяйте обработку кислотой до тех пор, пока краситель не перестанет стекать со стекла (на это потребуется не менее 10 минут) 9. Залейте стекло 95% спиртом и оставьте на 2 минуты 10. Смойте водой 11. Покрасьте метиленовым синим Леффлера или 0,1% малахитовым зеленым в течение 20 секунд. Примечания. · Некоторые растворы, использующиеся в данном методе, обладают сильным коррозирующим действием. При работе используйте защитные очки. Соблюдайте правила техники безопасности при работе в лаборатории. · При модифицированном способе окраски по Цилю-Нильсену на 6 ступени используется 5% серная кислота. Подпись к рисунку: Положительный результат окраски по Цилю-Нильсену

Рис. 1.7: Окраска по Цилю-Нильсену. Фотография микобактерий туберкулеза, выделенных от кошки. С любезного разрешения д-ра Дэвида Тейлора.

 

При подозрении на микобактериальную инфекцию на основании окраски по ЦН образец с хорошо заметной предупредительной надписью необходимо отослать в соответствующую лабораторию. Целесообразно перед этим позвонить в лабораторию.

Слабо-кислотоустойчивые микроорганизмы не обесцвечиваются 5% серной кислотой (модифицированный метод ЦН), но обесцвечиваются 20%. К таким микроорганизмам относятся бруцеллы и нокардии.

Гистопатология.

Микроорганизмы можно идентифицировать гистопатологическими методами, хотя ими определяют только морфологию (например, палочки, кокки). В некоторых случаях возможна более точная идентификация, например, лептоспир в биоптатах почек, геликобактерий в биоптатах желудка, или кампилобактерий в биоптатах толстого кишечника.