Цепная полимеразная реакция.

Цепная полимеразная реакция (ЦПР) позволяет многократно реплицировать ДНК, содержащуюся в очень малой концентрации, при помощи фермента – термостабильной ДНК-полимеразы, создающей копию молекулы на матрице ДНК. Участком начала амплификации служит короткий участок ДНК, так называемый праймер, связанный со специфичной областью ДНК микроорганизма. После каждой фазы полимеризации реакционную смесь нагревают для разъединения цепей ДНК, и, таким образом, появляются новые участки для связывания праймеров и запуска новых циклов полимеризации. Амплифицированную ДНК затем отделяют от смеси нуклеотидов в геле. Это можно сделать различными способами (чаще всего с помощью окраски красителем, флуоресцирующем в ультрафиолетовом свете). Эта технология может применяться и для определения РНК-содержащих вирусов; в этом случае сначала добавляют обратную транскриптазу, создающую ДНК-копию вирусной РНК. Принцип «обратной ЦПР» показан на рис. 1.5. Главным преимуществом этого метода является его высокая чувствительность. Теоретически возможно определить одиночный организм, но на практике часто требуются большие их количества, до нескольких сотен. Метод ЦПР очень специфичен (имеющиеся праймеры подвергаются тщательному отбору).

Главный недостаток метода ЦПР – возможность ложноположительных результатов из-за высокой чувствительности. Причиной может служить контаминация образца, праймеров, фермента или нуклеотидов. И если лаборатории могут контролировать контаминацию своих реагентов, то контаминация образца возможна в процессе работы. Высокая чувствительность затрудняет интерпретацию положительных результатов. Большинство тест-систем на основе ЦПР предназначены для качественного анализа, хотя возможен и полуколичественный. Качественный анализ показывает только наличие или отсутствие организма. При некоторых инфекциях присутствие микроорганизмов в небольшом количестве не имеет клинического значения, и, следовательно, при использовании метода ЦПР возможна гипердиагностика. Другая проблема, не столь значительная, возникает из-за высокой специфичности реакции. Подбор неподходящих праймеров может дать ложноотрицательный результат. При методе обратной ЦПР ложноотрицательный результат может получиться в результате разрушения РНК посторонними ферментами. Праймеры нужно получать из ДНК с известной последовательностью, не менее нескольких лет определяемой у вирусов различных штаммов, происходящих из различных географических районов.

На данный момент существуют тест-системы для диагностики широкого спектра возбудителей, включая вирусы лейкоза, иммунодефицита, герпесвирус и коронавирус кошек, парвовирус собак, Clamiydophila felis (ранее Chlamidia psittaci var. Felis) и Haemobartonella felis. В будущем их станет больше. При интерпретации результатов, полученных данным методом, нужно всегда учитывать клиническую информацию; не следует ставить диагноз только по результатам ЦПР.

 

Подписи к рисункам.

Рис. 1.4: Цепная полимеразная реакция. Пара праймеров, связывающихся со специфичными комплементарными участками одноцепочечной ДНК (образовавшейся после нагревания двойной спирали ДНК), служат точками начала полимеризации. В результате повторяющегося (от 20 до 30 раз) цикла разделения, связывания праймеров и полимеризации происходит амплификация определенного участка ДНК. Получившаяся смесь затем разделяется методом электрофореза в геле. Гель, содержащий ДНК, окрашивается (часто используются красители, содержащие флуоресцентный компонент – бромид этидия). На фото: исследуемые образцы – от С35/1 до С210, левая полоса содержит маркеры определенных размеров; самые правые полосы – “ neg ” и “ pos ” – отрицательный и положительный контроли.(с любезного разрешения Майкла МакДональда)

Рис. 1.5. Обратная цепная полимеразная реакция. Это модификация ЦПР (см. рис. 1.4.), в которой фермент обратная транскриптаза синтезирует одноцепочечную ДНК на матрице РНК. Комплементарная ДНК образуется в одиночном цикле полимеризации.

 

Надписи на рис. 1.4. 1. Двухцепочечная ДНК разделяется нагреванием 2. «Отжиг» праймеров, которые соединяются с ДНК 3. При помощи термостабильной ДНК-полимеразы создается копия ДНК 4. Цепи ДНК снова разделяются нагреванием 5. При охлаждении смеси большее количество праймеров соединяется с ДНК 6. Образуется больше копий ДНК, но длина некоторых матриц препятствует дальнейшей элонгации 7. Новый цикл нагревания, «отжига» и элонгации приводит к образованию новых копий коротких фрагментов первоначальной молекулы ДНК 8. После 30 циклов репликации число копий одной ДНК достигает 264 миллионов.

 

 

Надписи на рис. 1.5 РНК-содержащий вирус (например, коронавирус кошек) Разрушение вируса Экстракция ДНК кДНК  обратная транскрипция РНК ЦПР (см. рис.1.4.) Множественные копии ДНК можно идентифицировать методом электрофореза в геле.

 

Гистопатология, иммуногистохимия и методы in situ.

Не следует недооценивать гистопатологические методы диагностики вирусных инфекций. Многие вирусы вызывают характерные патологические изменения и образуют тельца включения. К основным недостаткам этого метода относятся необходимость биопсии и длительный процесс интерпретации результатов, который должен выполнять опытный персонал.

Для определения возбудителя можно применять иммуногистохимические методы. Принцип иммуногистохимии сходен с принципом иммунофлуоресценции (см. ниже), правда, при этом используют фиксированные ткани, а не культуры клеток. Кроме того, необходимы различные конъюгаты и разные способы обработки.

Гибридизация in situ используется для выявления специфических последовательностей ДНК (например, вирусных регуляторных генов) в фиксированных тканях. Для такой технологии требуются специальные фиксаторы, так как ткани, фиксированные формалином, могут оказаться непригодны. Мы не знаем примеров клинической диагностики инфекционных болезней при помощи данного метода. Возможно, техника ЦПР in situ станет более популярной в будущем, но в настоящее время ее применение ограничено экспериментальной работой.

 

Серологические методы.

Существует несколько методов серологической диагностики вирусных инфекций. Они будут описаны ниже в этой главе.

 

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Бактерии часто видны в окрашенных мазках, но обычно этого недостаточно для постановки окончательного диагноза. Точно идентифицировать организм, основываясь только на его морфологии или способе окраски, невозможно. Для определения большинства видов бактерий необходим посев на среды. Это можно сделать самостоятельно, либо отправить образец в лабораторию. Обычно, анализ в лаборатории предпочтительнее по следующим причинам:

· Существуют правила техники безопасности для персонала, выполняющего анализы, а также правила утилизации культуральных материалов. В Великобритании работы с обычными образцами требуется проводить в лабораториях второй катергории, а работы с такими микроорганизмами, как Mycobacterium spp и Chlamydophila felis – в лабораториях третьей категории, оборудованных кабинетом безопасности 1 класса. (см. МакКандлиш и Тэйлор, 1998).

· Для многих бактерий необходим термостат с температурой выше комнатной. Культивирование при разных температурах может помочь при дифференциации различных штаммов некоторых видов бактерий (например, Pseudomonas, Campylobacter и др.).

· Для культивирования разных микроорганизмов (например, Staphilococcus, Campylobacter) необходимы различные селективные среды, подавляющие рост остальной микрофлоры. С помощью селективных сред можно быстро идентифицировать некоторые бактерии (например, Salmonella, Bordetella, Streptococcus). Кроме того, необходимы среды обогащения для усиления роста некоторых требовательных микроорганизмов.

· Для того, чтобы правильно идентифицировать бактерии в культуре и провести тесты на чувствительность, нужно обладать значительным опытом.

 

Очень важен способ отбора проб для бактериологического исследования: образец берут с пораженных участков и отправляют в лабораторию с точным указанием места взятия пробы. Такая информация необходима для выбора подходящей культуральной среды и определения чувствительности к антибиотикам. Рекомендуется сделать мазок-отпечаток на стекле, непосредственно с пораженного места или из смыва. Мазок можно окрасить по Граму и исследовать под микроскопом, это поможет выбрать подходящую культуральную среду. Некоторые микроорганизмы, например, Campylobacter spp., Helicobacter spp., Brachyspire spp. и дрожжи можно идентифицировать в мазке, окрашенном по Граму, но нельзя выделить либо из-за их требовательности к составу среды, либо из-за подавления посторонней микрофлорой (например, протеем).