Определение вируснейтрализующих антител 


Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Определение вируснейтрализующих антител



Для определения вируснейтрализующих антител образец сыворотки инкубируют с вирусом непродолжительное время, а затем в систему вводят восприимчивые клетки, которые начинают расти. Если вирус нейтрализован, признаки заражения не появятся. Определение вируснейтрализующей способности сыворотки является одним из наиболее прямых методов, подтверждающих присутствие вирусных антител. Антитела, определяющиеся данным методом, очень важны, так как свидетельствуют об иммунности животного к вирусу (кроме некоторых вирусов, например, коронавируса кошек или вируса иммунодефицита кошек). Главный недостаток метода – в необходимости работы с живыми вирусами и культурами клеток. Анализ обычно требует специального оборудования, и может занимать несколько дней. При многих вирусных инфекциях титры антител, определенные другими методами, например, иммуноферментным анализом, коррелируют с титрами, полученными при определении вируснейтрализующих антител, таким образом, последний представляет только академический интерес. Например, результаты измерения титров антител к парвовирусу методом гемагглютинации коррелируют с результатами, полученными при определении вируснейтрализующих антител. Исключение – определение титра антител к вирусу лейкоза кошек, результаты которого не коррелируют с результатами, полученными другими методами.

 

Иммунодиффузия в агаровом геле

Иммунодиффузия в агаровом геле – один из простейших серологических методов. Он основан на пассивной диффузии антигена и антитела навстречу друг другу. Область формирования иммунного комплекса проявляется в виде белой полоски в геле. Для успешного выполнения теста необходимы очень высокие концентрации антител и антигенов, поэтому данный метод применяется только в редких случаях. Единственный пример – серологическое определение Aspergillis fumigatus.

 

Задержка гемагглютинации

Метод задержки гемагглютинации (ЗГА) является модификацией метода гемагглютинации (см. ранее) и используется в основном для определения титров антител к парвовирусам. Тест выполняется подобно гемагглютинации. Образец сыворотки смешивается с известным количеством вируса и оценивается уменьшение агглютинирующей способности. Титр можно вычислить методом разведения образцов сыворотки. Принцип ЗГА показан на рисунке 1.15.

 

  1. Эритроциты
  2. Вирус
  3. Антитело
  4. Сыворотка в разведении 1:128
  5. Сыворотка в разведении 1:512
 

Рис. 1.15: Метод задержки гемагглютаниции. В нормальных условиях вирус вызывает агглютинацию эритроцитов. Присутствие антител в достаточном количестве препятствует этому процессу. Образцы в рядах, отмеченных стрелками, содержат антитела (положительные). По мере разведения сыворотки концентрация антител уменьшается и, наконец, становится слишком низкой для того, чтобы подавить агглютинацию. Регистрируют титр, при котором агглютинация возникает снова. Это фото является репродукцией из Руководства по клинической патологии мелких животных под редакцией Дэвидсона, Элса и Лумсдена (1998), опубликованного BSAVA.

 

Латексная агглютинация

Метод латексной агглютинации аналогичен методу гемагглютинации, но красные кровяные клетки заменены латексными шариками, покрытыми слоем антигена. Тест относительно малочувствителен, обнаруживаются только антитела в достаточно больших титрах. Этот метод часто используется для определения Toxoplasma gondii и Aspergillus fumigatus.

 

Иммунофлуоресцентный анализ

В прямом методе иммунофлуоресценции (ИФА) используются антитела, маркированные флуоресцентным веществом. Антитела связываются с белками-мишенями на поверхности клеток и флуоресцируют при облучении ультрафиолетовым светом. Перед исследованием под микроскопом препарат промывают для удаления несвязанных антител. Для выявления зараженных клеток в толще ткани этот метод не подходит.

Непрямой метод иммунофлуоресценции используется для выявления антител в образце сыворотки с помощью анти-иммуноглобулина, маркированного флуоресцентным веществом. В качестве мишеней для антител используются клетки, зараженные в лаборатории. Принцип метода показан на рисунке 1.16.

Для обоих методов требуются темные комнаты, микроскопы с источником ультрафиолетового света и культуры клеток.

Флуоресценция зараженных клеток при отсутствии флуоресценции незараженных указывает на положительный результат. Обычной проблемой ИФА является неспецифическая флуоресценция, и для ослабления этого эффекта обычно используют смесь зараженных и незараженных клеток. Если флуоресцируют все клетки, хотя заражены только некоторые, это проявление неспецифической реакции. Флуоресценция со временем уменьшается и при облучении ультрафиолетовым светом. Следовательно, повторное исследование образца не допускается и тест необходимо повторить. От опытного специалиста требуется отличать действительную флуоресценцию от неспецифической.

1. Клетки в культуре 2. Половина клеток в культуре заражается вирусом 3. Клетки, зараженные вирусом 4. Клетки инкубируются с исследуемой сывороткой. Антитела к вирусу связываются с клетками 5. Антитело в образце 6. Клетки затем инкубируются с анти-иммуноглобудлином, связанным с флуоресцином 7. Анти-иммуноглобулин, меченый флуоресцином             Подписи к фото на рисунке: Положительный результат – флуоресцируют только зараженные клетки Неспецифический результат – флуоресцируют все клетки

Рис. 1.16: непрямой метод иммунофлуоресценции. Из исследуемой сыворотки приготовляют разведения 1:4, 1:8, 1:16 и т.д.; последнее разведение, при котором наблюдается флуоресценция, соответствует титру антител животного. Незараженные клетки служат внутренним отрицательным контролем для каждого разведения сыворотки. Если флуоресцируют все клетки, то реакция неспецифическая и необходимо дополнительное исследование, например, иммуноблоттинг. Фото с примером неспецифической флуоресценции любезно предоставлено доктором Мэттом Голдером.

1. Вирус (например, вирус иммунодефицита кошек) 2. Разрушенный вирус 3. Вестерн-блот

Рис. 1.17. Вестерн-блоттинг. Вирус очищают, разрушают и разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. В данном примере показан вирус иммунодефицита кошек. Вирусные белки затем переносятся на нитроцеллюлозную мембрану, и туда же наносятся антитела. Связанные антитела можно увидеть после окраски специальным красителем.Фото с результатами блоттинга публикуется с любезного разрешения д-ра Маргарет Хойс.

Иммуноблоттинг

Методом иммуноблоттинга (также известного как вестерн-блоттинг) можно не только идентифицировать связанные с вирусом антитела, но также определить, какие именно белки ими узнаются. Принцип метода показан на рис. 1.17.

Вирусные или бактериальные белки с целью получения длинных аминокислотных цепей без структур высшего порядка обычно денатурируют сильными детергентами. Эти цепи разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. После разделения белки переносят на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану, которую затем погружают в раствор антител. Связывание антител с вирусными белками определяют с помощью второго иммуноглобулина, меченого ферментом.

Иммуноблоттинг – длительный и дорогостоящий метод, который редко применяют для диагностики, только в случае сомнительных результатов других иммунологических тестов. Однако, этот метод считается определяющим для некоторых инфекций, например, иммунодефицита кошек.

  А) Истинно положительный результат Б) Вторичное антитело, связанное с цветообразующим соединением В) Первичное антитело Г) Связывающее антитело – «ловушка» Д) Отрицательный Е) Слабо положительный Ж) Определенно положительный

Рис. 1.18. Твердофазный иммуноферментный анализ. В данном примере определяется белок р27 вируса лейкоза кошек. Фотография результатов теста любезно предоставлена профессором Освальдом Джареттом.



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2020-03-13; просмотров: 558; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 184.72.135.210 (0.065 с.)