Методики концентрации микрофилярий

Существует несколько методов концентрирования кровепаразитов. Наиболее широко используется модифицированный метод Кнотта (рис. 1.14).

Кроме того, есть готовые тест-системы для концентрирования методом фильтрации. Отрицательные результаты, полученные данным методом, недостоверны; примерно у 25% собак, зараженных сердечными гельминтами, микрофилярии в крови отсутствуют.

 

Оборудование: шприц 2 мл, игла № 23, несколько предметных стекол, одно стекло для размазывания (его можно изготовить, отрезав уголок обычного стекла стеклорезом), краситель типа Романовского Приготовление красителя: Май-Грюнвальда Поместите 0,3 г порошка в 200–250 мл колбу. Добавьте 100 мл метанола и подогрейте до 50 ^оС. Остудите до комнатной температуры, встряхивайте несколько раз в течение дня. После отстаивания в течение 24 часов профильтруйте. Гимзы Поместите навеску порошка массой 1 г в колбу. Добавьте 100 мл метанола и подогрейте до 50 ^оС. Сохраняйте такую температуру в течение 15 минут при периодическом встряхивании, зачем профильтруйте. При отстаивании качество красителя улучшается. Буферный раствор Соренсена А. 9,1 г/л КН2РО4 В. 9,5 г/л Na2HРО4 или 11,9 г/л Na2HРО4 · 2 Н2О Для получения раствора с рН 6,8 смешайте 50,8 мл раствора А с 49,2 мл раствора В. Методика. 1. Возьмите 1 мл крови иглой № 23 2. Нанесите небольшую каплю крови на концы обоих стекол 3. Возьмите третье стекло и прикоснитесь им к капле крови на предметном стекле; угол наклона стекла должен быть около 45^о. 4. Быстро размажьте каплю по всей длине стекла. Мазок должен быть гладким. Повторите то же самое со вторым стеклом. 5. Высушите мазки на воздухе 6. Зафиксируйте метанолом в течение 10–20 минут 7. Поместите в емкость с красителем Май-Грюнвальда, разведенного равным объемом буфера; краситель разводят непосредственно перед окрашиванием. 8. Через 15 минут, не смывая, переместите мазок в емкость с красителем Гимзы, разведенным девятикратным объемом буфера; краситель разводят непосредственно перед окрашиванием. 9. Спустя 10–15 минут перенесите стекло в стакан с буфером и промойте 3–4 раза, после каждой промывки наливая свежую воду. 10. Оставьте в буфере на 2–5 минут 11. Поставьте стекла вертикально для просушки 12. Можно использовать экспресс-красители, например, Diff-Quick®, в соответствии с инструкцией производителя, но качество будет хуже. Примечания. Капля должна быть небольшой; тонкие мазки лучше толстых Игла небольшого диаметра позволяет лучше контролировать размер капли, при осторожном взятии крови повреждения красных кровяных клеток можно свести к минимуму. Осадок красителя легко принять за паразитов на поверхности эритроцита, например, за Haemobartonella felis или H. canis.

Рис. 1.12: Приготовление мазка крови. На фото показана Haemobartonella canis в мазке крови

 

 

Методика. Смешайте 100 мкл цельной крови с 100 мл акридинового оранжевого, свежеразведенного в боратном буфере Соренсона с рН 9,0, в соотношении 1:20000. Нанесите каплю смеси на предметное стекло, очищенное спиртом, и накройте покровным стеклом. Оставьте на 5 минут во влажной атмосфере и просмотрите под микроскопом в ультрафиолетовом свете. До микроскопии держите стекла в темном месте. ИЛИ 1. Залейте стекло, высушенное на воздухе, раствором акридинового оранжевого и оставьте на 5 минут. 2. Просмотрите под микроскопом в ультрафиолетовом свете. Небольшие флуоресцирующие включения на поверхности эритроцитов – признак присутствия гемобартонелл.

Рис. 1.13: Окраска акридиновым оранжевым для определения Haemobartonella felis. Пример показан на рисунке 5.8а.

 

Методика 1. Смешайте 1 мл цельной крови с 10 мл 2%-ного раствора формальдегида и оставьте на 15 минут. 2. Отцентрифугируйте смесь 5 минут при скорости 1500 об/мин. 3. Удалите надосадочную жидкость и суспендируйте остаток в капле метиленового синего, разведенного 1:1000. 4. Нанесите небольшую каплю смеси на предметное стекло и накройте покровным стеклом.

Рис. 1.14: Модифицированный способ Кнотта. На фотографии показана микрофилярия Dirofilaria immitis. Этот паразит слабо отличается от безвредной миркрофилярии Dipetalonema reconditum, для постановки диагноза может потребоваться консультация эксперта. (с любезного разрешения д-ра Сюзан Шоу).

 

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Диагностика инфекционных болезней методом определения специфических антител стала общепринятой практикой, особенно если постановка диагноза другими способами затруднительна или дорогая. Серология широко используется при популяционных исследованиях, в некоторых программах скрининга и при тестировании вакцин.

Серологические методы имеют некоторые недостатки:

· Присутствие антител не всегда является показателем активной инфекции, а может отражать ранее перенесенные заболевания

· Антитела могут вырабатываться на непатогенный организм, родственный патогенному

· Выработка антител занимает некоторое время, следовательно, серологические тесты менее эффективны при острых инфекционных заболеваниях

· При серологическом исследовании парных образцов концентрация антител может достичь максимума к моменту появления клинических признаков

· Титры антител могут оставаться низкими у животных с ослабленным иммунитетом.

 

Большинство этих факторов создают впечатление, что значимость серологической конверсии превышает значимость клинических проявлений. Клиницисты никогда не должны путать серологическую конверсию с демонстрацией возбудителя.

Важно, чтобы в серологических методах использовались белки-мишени, характерные для исследуемого заболевания. Например, при диагностике возбудителя заболевания сельскохозяйственных животных и человека, но имеющего также штаммы, патогенные для мелких животных, можно с большой вероятностью получить ложноотрицательный результат. В равной степени, присутствие материнских антител может привести к ложноположительному результату. К тому же нужно помнить, что изменение условий теста может дать ложноположительный или ложноотрицательный результат независимо от наличия или отсутствия антител. Это может произойти либо из-за неспособности антител связывать антиген, либо в результате неспецифической реакции антител с антигеном.

 

Парные образцы.

За классический показатель активной инфекции в организме принимается 4-кратное увеличение титра антител. К сожалению, отобрать пробу в начальный период болезни часто бывает невозможно. И даже если это возможно, некоторые заболевания, например, парвовирусный энтерит, характеризуются настолько быстрым подъемом уровня антител, что титр будет максимальным уже в первой пробе. Кроме того, при заражении вирусами, подавляющими иммунную систему (например, вирус чумы плотоядных), увеличения титра может не быть вовсе. Вероятно, определение специфических IgM в будущем заменит метод парных образцов.

 

Классы антител.

На данный момент существует несколько тест-систем, определяющих только IgM, образующиеся в ответ на определенные патогены, например, Т oxoplasma gondii. Обычно IgM не остаются после выздоровления, и, следовательно, их высокий титр является показателем недавнего заражения. Длительность персистирования IgM может варьировать в зависимости от индивидуальных особенностей животного и природы антигена. Например, у кошек время персистирования антител класса IgM к Т oxoplasma gondii обычносоставляет около 6 недель, но иногда может длиться до 6 месяцев. Определение титра IgM может вызывать затруднения; проблемой являются перекрестные реакции с IgG.