Методы выделения флавоноидов из лрс

Для флавоноидов не существует универсального метода выделения из растительного сырья. В каждом конкретном случае учитываются свойства выделяемых веществ, сопутствующие вещества и особенности растительного сырья.

Для выделения флавоноидов проводят экстрацию ЛРС одним из подходящих растворителей: этанолом, метанолом, горячей водой или спирто-водной смесью.

Для очистки и разделения используют:

1) избирательную экстракцию; 2) осаждение солями тяжелых металлов;

3) хроматографические методы.

Выделение флавоноидов из ЛРС
с использованием избирательной экстракции (схема 9)

1. Экстракция суммы флавоноидов из ЛРС (70%,80% этанолом или метанолом).

2. Отгонка спирта под вакуумом до водного остатка.

3. Очистка полученной суммы флавоноидов СCl4от липофильных веществ.

4. Разделение флавоноидов на фракции растворителями с возрастающей полярностью:

1) экстракция агликонов этиловым эфиром;

2) экстракция моногликозидов этилацетатом;

3) экстракция биозидов, триозидов и др. полярных флавоноидов н-бутанолом.

5. Разделяют полученные фракции с помощью колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте, силикагеле или целлюлозе. Элюирование веществ проводят смесью хлороформа с этанолом или спирто-водными смесями с возрастающей концентрацией спирта.

Контроль за ходом разделения флавоноидов проводят методом хроматографии: используют ТСХ, БХ или высокоэффективную газожидкостную хроматографию. Наиболее подходящими системами для БХ флавоноидов являются:

15%, 60% РАСТВОРЫ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ;

БУТАНОЛ - УКСУСНАЯ КИСЛОТА - ВОДА (4:1:5).

Для ТСХ: ХЛОРОФОРМ-МЕТАНОЛ (8:2).

6. Установление структуры выделенных соединений проводят с помощью физико-химических методов:

· определение температуры плавления;

· определение удельного вращения (гликозидов);

· сравнение УФ-, ИК-, масс-, ПМР-спектров со спектрами

известных образцов.

Схема 9

Качественное определение

Для обнаружения флавоноидов в ЛРС используют химические реакции и хроматографию. Химические реакции подразделяются на цветные и реакции осаждения.

I. Цветные реакции

1. Специфической реакцией на флавоноиды является цианидиновая проба (проба Шинода), основанная на восстановлении карбонильной группы атомарным водородом в кислой среде в присутствии металлического магния и образовании антоцианидинов. Продукты восстановления флавонов имеют окраску оранжевую, флаванолов, флаванонов - красно-фиолетовую. При использовании цинка положительную реакцию дают флаванолы и флаванол-3-гликозиды, а флаваноны не дают её. Цианидиновую реакцию не дают также изофлавоны, неофлавоноиды, халконы и ауроны. Халконы и ауроны образуют красное окрашивание при добавлении концентрированной хлористоводородной кислоты за счет образования оксониевых солей.

 

 

ЦИАНИДИН ХЛОРИД

 

Цианидиновая реакция по Брианту позволяет определить агликоновую или гликозидную природу исследуемого вещества. К окрашенному раствору продукта цианидиновой реакции прибавляют равный объём н-октанола(или бутанола), разбавляют водой до разделения слоёв и встряхивают. Гликозиды остаются в воде, а агликоны переходят в слой органического растворителя.

2. Реакция со щелочами (аммиаком) - флавоноиды дают различную окраску от желтой до коричневой; халконы и ауроны со щелочами дают красное окрашивание или ярко-желтое; антоцианидины - синее окрашивание.

3. Флавоноиды, благодаря карбонильным и фенольным оксигруппам, способны образовывать комплексы с солями металлов:

· с хлоридом окисного железа (III) флавоноиды образуют комплексы, окрашенные в различные цвета в зависимости от структуры (от зеленого до коричневого цвета);

· борно-лимонная реакция -

5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы взаимодействуют с борной кислотой в присутствии лимонной (или щавелевой), образуя комплекс ярко-желтого окрашивания с желто-зеленой флуоресценцией в УФ-свете.

Если флавонол или флавон не содержит гидроксил в 5 положении, то реакция протекает за счет гидроксила 3 положения;

 

 

· реакция с треххлористой сурьмой -

5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или красный цвет;

 

 

 

 

· многие флавоноиды дают окрашенные комплексы желтого цвета с 5% спиртовым раствором алюминия хлорида, с 2% спиртовым раствором циркония хлорида. Флавоноиды, имеющие две оксигруппы у С3 и С5, дают хелаты жёлтого цвета за

 

счёт образования водородных связей между карбонильной и гидроксильными группами:

4. Флавоноиды со свободной 7-оксигруппой вступают в реакцию с солями диазония, образуя оранжевые или красные продукты азосочетания.

II. Реакции осаждения

Все флавоноиды с основным ацетатом свинца образуют осадки, окрашенные в ярко-желтый или красный цвет.

Средним ацетатом свинца осаждаются лишь флавоноиды, содержащие свободные орто-гидроксильные группы в 3', 4' -положениях кольца В.

III. Хроматография

Для обнаружения флавоноидов в растительном материале широко используется бумажная и тонкослойная хроматография. Обнаружение флавоноидов на хроматограммах проводят:

· по окраске пятен в видимом свете (антоцианы);

· по характеру свечения в УФ-свете: флавоны, флавонол-3-О-гликозиды, флаваноны и халконы обнаруживаются в виде темно-коричневых пятен, флавонолы и их 7-О-гликозиды - в виде желтых или желто-зеленых;

· по характеру свечения в УФ-свете после проявления 5%-ным спиртовым раствором хлорида алюминия и последующего прогревания хроматограммы при 105°С в течение 2-3 мин: наблюдают пятна флавоноидов с интенсивной желтой и желто-зеленой флуоресценцией.

Количественное определение

Для количественного определения флавоноидов в растительном сырье наибольшее распространение получили физико- химические методы, прежде всего фотоколориметрия и спектрофотометрия.

1. Фотоколориметрический метод основан:

· на цветных реакциях комплексообразования с солями различных металлов (алюминия, циркония, хрома, сурьмы);

· на реакции с лимонно-борным реактивом;

· на реакции восстановления атомарным водородом в кислой среде в присутствии металлического магния или цинка.

2. Спектрофотометрический метод, основанный на способности флавоноидов поглощать свет в УФ-области спектра.

3. Хромато-спектрофотометрический метод - более совершенный метод количественного определения флавоноидов, используется в сочетании с хроматографией, что позволяет произвести очистку и разделение суммы веществ на отдельные компоненты.

Реже используют:

4. Флюориметрический метод.

5. Полярографический метод.

6. Наличие фенольных гидроксилов, обуславливающих слабокислые свойства флавоноидов, позволяет использовать метод кислотно-основного титрования в неводных растворителях: диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ацетоне.