Методы обнаружения сапонинов в ЛРС

Для обнаружения сапонинов в ЛРС используются реакции, основанные на: 1. физических;

2. химических;

3. биологических свойствах этих веществ.

Для качественных реакций на сапонины готовят водное извлечение из ЛРС (1:10) на кипящей водяной бане в течение 10 минут, после охлаждения и фильтрации проводят необходимые реакции.

Реакции, основанные на физических свойствах

Реакция пенообразования:

При встряхивании в пробирке водного извлечения образуется довольно устойчивая пена.

 

По пенообразованию ориентировочно определяется и групповая принадлежность сапонинов. Для проведения реакции водное извлечение из ЛРС делят на две части: первую подкисляют до рН=1, вторую подщелачивают до рН=13. Оба раствора в пробирках встряхивают. Наблюдают образование столбиков пены. Если в обеих пробирках образуется примерно равные по величине и стойкости столбики пены или в рпобирке с кислой средой, то сырье содержит тритерпеновые сапонины, если столбик пены больше при щелочном рН, то - стероидные.

Реакции, основанные на химических свойствах

1) Реакции осаждения:

· Из водных растворов сапонины осаждаются гидроксидом бария или магния, солями меди, ацетатом свинца, причем тритерпеновые сапонины осаждаются средним ацетатом свинца, а стероидные - основным.

· Из спиртовых извлечениий стероидные и тритерпеновые сапонины осаждаются спиртовым раствором холестерина в виде комплексов - холестеридов.

2) Цветные реакции:

· реакция Либермана-Бурхарда: сухой остаток растворяют в ледяной уксусной кислоте и добавляют смесь уксусного ангидрида с концентрированной серной кислотой (50:1). Наблюдают розовое окрашивание, переходящее в зеленое, а затем в синее;

· реакция с 10% раствором нитрита натрия и концентрированной серной кислотой, наблюдают кроваво-красное окрашивание;

· реакция Лафона: к водному извлечению прибавляют конц. H2SO4 и этиловый спирт (в равных объемах), затем прибавляют каплю раствора сернокислого железа. При нагревании появляется сине-зеленое окрашивание;

· реакция с серной кислотой: к извлечению прибавляют равный объем хлороформа и 6-8 капель концентрированной серной кислоты. Наблюдают окрашивание нижнего хлороформного слоя в желтый цвет.

стероидные сапонины можно отличить по реакции Санье: с 1% раствором сурьмы трёххлористой, кислотой конц. серной, содержащей уксусный ангидрид, образуется жёлтое окрашивание.

Реакция, основанная на биологических свойствах

Реакция гемолиза эритроцитов:

Для проведения этой реакции используют эритроциты крови разных животных. Присутствие холестерина в плазме крови может задерживать гемолиз, поэтому кровь необходимо дефибринировать. Концентрация водородных ионов среды оказывает существенное влияние на гемолиз. Учитывая это, готовят: 1% извлечение из ЛРС и 2% взвесь эритроцитов на физиологическом растворе (или на буферной смеси фосфатов с pH=7,4). Смешивают равные объемы извлечения из ЛРС и взвеси эритроцитов, через некоторое время кровь становится прозрачной, ярко-красной (произошел гемолиз).

Хроматография

Для обнаружения сапонинов в ЛРС широко используют тонкослойную хроматографию на силикагеле в системе растворителей ХЛОРОФОРМ-МЕТАНОЛ-ВОДА (65:35:10). Для обнаружения зон сорбции сапонинов на хроматограммах используют следующие реактивы:

· пары йода - бурые пятна на желтом фоне;

· насыщенный раствор треххлористой сурьмы в хлороформе с последующим нагреванием при 90-100°С - розово-фиолетовые пятна;

· спиртовый раствор фосфорно-молибденовой кислоты - синие пятна на желтом или желто-зеленом фоне (окраска фона снимается парами аммиака);

· спиртовым раствором кремне-вольфрамовой кислоты с последующим нагреванием при 100-120°С - розовые, оранжевые, красные, фиолетовые, серые и др. пятна на бесцветном фоне;

· реактив Санье (5% спиртовый раствор ванилина) с нагреванием при 110°С и последующей обработкой 50% водным раствором серной кислоты - спиростаноловые сапонины проявляются в виде желтых пятен, фуростаноловые - зеленых;

· реактив Эрлиха (спиртовый раствор п-диметиламинобензальдегида с добавлением концентрированной HCl) - фуростаноловые сапонины проявляются в виде пятен розового или красного цвета;

· для обнаружения тритерпеновых сапонинов хроматограмму обрабатывают 20% раствором серной кислоты, нагревают в сушильном шкафу при температуре 115-120°С в течение 15 мин - появляются фиолетовые пятна.