Определение билирубина в сыворотке крови

Билирубин в незначительных количествах может быть обнаружен в сыво­ротке крови здоровых животных, в больших же количествах он появляется только при патологических процессах.

Желчные пигменты образуются из гемоглобина распавшихся эритроци­тов. В клетках ретикуло-эндотелиальной системы из пигментов расщеплен­ного гемоглобина синтезируется билирубин, связанный с глобулинами. Этот билирубин выделяется в кровь, окрашивая ее сыворотку в желтоватый цвет. Из крови билирубин улавливается купферовскими клетками печени и затем передается печеночным эпителиальным клеткам, которые видоизменяют его, освобождая от глобулинов. Измененный билирубин через желчные пути посту­пает в кишечник и здесь превращается в уробилиноген. Часть этого пигмента всасывается из кишечника в кровь, а часть выводится в виде стеркобилина с фекальными массами.

Билирубин, связанный с глобулинами, называется билирубином, не про­веденным через печень. Повышенное содержание такого билирубина в крови отмечается при гемолитических желтухах. Чем значительнее распад эритро­цитов, тем больше в сыворотке крови билирубина, не проведенного через печень (гемоспоридиозы, отравление гемолитическими ядами).

Билирубин, не связанный с глобулинами, называется проведенным через печень. Повышенное количество такого билирубина в сыворотке крови обна­руживается при различного рода препятствиях к оттоку его из желчных путей в кишечник. Билирубин в этом случае начинает поступать в кровь (закупорка желчных ходов, болезни печени).

Установление разновидностей билирубина имеет практическое значение при дифференциации желтух.

Для определения билирубина в сыворотке крови существует несколько способов.

Способ Ван-ден Берга — наиболее точный. Для постановки реакции необходимы колориметр Аутенрита или Дюбоска, диазореактивы Эрлиха, 96° спирт и стандартный раствор.

Рабочую смесь готовят из разных диазореактивов. Первый реактив — сульфаниловой кислоты 1,0, соляной кислоты 15 мл (удельный вес 1,125) и дистиллированной воды 1 л; второй реактив — азотистокислого натрия 0,5 и дистиллированной воды 100 мл. Рабочий реактив получают, смешивая 8 мл первого реактива и 0,25 мл второго.

Наилучшим и наиболее употребительным является кобальтовый стан­дартный раствор. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2,161 г серно­кислого кобальта, предварительно освобожденного нагреванием от кристал­лизационной воды, или 3,92 г кристаллического CoSO₄-7H₂O. Этот раствор соответствует раствору билирубина 1: 200 000 (0,5 мг%).

Стандартом такой же окраски, но менее стойким, является смесь двух растворов, получаемых следующим образом.

1. В колбочке емкостью 100 мл в небольшом количестве воды растворяют 0,1508 железоаммиачных квасцов и прибавляют затем 50 мл соляной кислоты (удельный вес 1,19). После этого уровень жидкости доводят водой до метки 100. Из этого основного раствора, имеющего 1/320 нормальности, приготов­ляют рабочий реактив (1/8000 нормальности): в колбу емкостью 250 мл поме­щают 10 мл основного раствора, смешивают его с 25 мл соляной кислоты и доливают водой до 250 мл. Рабочий реактив годен для работы в течение нескольких месяцев.

2. 10% раствор роданистого калия (или роданистого аммония). К 3 мл рабочего реактива прибавляют в делительной воронке 3 мл 10% раствора роданистого калия и 12 мл серного эфира. При постоянном охлаждении дели­тельной воронки под краном жидкость смешивают до тех пор, пока родани­стое железо не будет экстрагировано эфиром. Этим розовым эфиром — раство­ром роданистого железа и пользуются в качестве стандарта. По своей окраске стандарт соответствует 0,5 мг билирубина на 100 мл сыворотки крови. Стан­дарт необходимо предохранять от испарения.

При исследовании к 2 мл испытуемой сыворотки добавляют 4 мл спирта и смесь центрифугируют 20 минут; 1 мл прозрачного раствора переносят в клин колориметра Аутенрита или в стаканчик колориметра Дюбоска и, при­бавив 0,5 мл спирта для растворения жирных кислот, обрабатывают 0,25 мл рабочего реактива. Наполнив затем второй стаканчик колориметра кобаль­товым стандартом или раствором роданистого железа, сравнивают окраску обоих растворов и устанавливают, на каких делениях шкалы получается иден­тичное окрашивание в обоих стаканчиках. Расчет производится по формуле:

 

 

При расчетах необходимо учитывать степень разведения сыворотки.

Способ основан на том, что при воздействии диазореактива на сыворотку крови, содержащую билирубин, образуется азобилирубин (диазосоль), придающий сыворотке розовое окрашивание. Следует, однако, иметь в виду, что окраска зависит от реакции среды: в нейтральной среде окрашивание получается розовое, в слабокислой среде эта окраска имеет слабо-фиолетовый оттенок. Такая же окраска получается при медленном выполнении исследо­вания.

Количество билирубина (в миллиграммах на 100 мл) в сыворотке крови здоровой лошади колеблется в пределах 0,37—3,0, среднее 1,1.

Методом Ван-деы Берга можно установить и разновидность билирубина.

Прямая реакция. Появление окрашивания после добавления одного рабочего реактива носит название прямой реакции. Окрашивание жидкости и притом различной интенсивности может наступить в неодинаковые сроки. Различают реакции: прямую быструю, когда жидкость окрашивается сейчас же после добавления реактива и окраска достигает максимума через 20—30 се­кунд, прямую двухфазную, если после добавления реактива жидкость окрашивается очень слабо, а затем окраска становится все более и более интенсивной, и прямую замедленную, когда окрашивание появляется спустя 10—15 минут.

Прямая реакция получается при наличии в крови билирубина, проведен­ного через печень, и всегда свидетельствует о патологии.

Прямая быстрая реакция указывает на механическую желтуху, связан­ную с препятствием к оттоку желчи (камни, паразиты, опухоль, стеноз желч­ных протоков, новообразования).

Прямая замедленная реакция отмечается при нарушении функции пече­ночных клеток (катаральная желтуха).

Прямая двухфазная реакция — признак желтухи смешанного характера.

Непрямая реакция. Если после добавления диазореактивов цвет жид­кости в течение 15 минут не изменяется, в пробирки добавляют спирт. Появле­ние вслед за этим розово-малинового окрашивания оценивается как непрямая реакция. Спирт разрушает связь билирубина с глобулинами крови. Чтобы отчетливее видеть окрашивание, в пробирки можно налить 0,5-мл эфира. Раз­ница между бесцветным слоем эфира и окрашенной испытуемой сывороткой выступает более отчетливо.

Непрямая реакция указывает на гемолитическую желтуху и получается при наличии билирубина, не проведенного через печень.

Способ Бокальчука. Для постановки пробы готовят два рас­твора по прописи: первый — сульфаниловой кислоты 1,0, соляной кислоты (удельный вес 1,19) 10 мл и дистиллированной воды 200 мл; второй — азотистокислого натрия 0,5 и дистиллированной воды 100 мл. Перед исследованием растворы смешивают в пропорции: 10 мл первого и 0,3 — второго.

Для определения билирубина в каждую из пяти пробирок наливают 0,5 физиологического раствора, а затем вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки. Перемешав жидкость, отсасывают пипеткой 0,5 мл смеси из первой пробирки и переносят ее во вторую пробирку. Из второй после перемешивания смеси переносят 0,5 мл в третью и т. д. Излишек в пятой пробирке удаляют, выливая в чашку. В результате получают разведения, кратные двум: 2, 4, 8, 16, 32, Затем в пробирки вносят по 0,5 мл рабочего реактива и осторожно смешивают. При наличии билирубина получается розовое окрашивание. Концом реак­ции считается разведение, в котором едва различимо это розовое окраши­вание.

Если окрашивание не наступило в течение 15 минут, в пробирки доба-нляют спирт. Помутневшая вследствие осаждения белка я идкость ври нали­чии билирубина окрашивается в розово-малиновый цвет. Чтобы лучше заме­тить в мутной жидкости изменение цвета, в пробирки наливают по 0,5 мл эфира и жидкость в них рассматривают на белом фоне. Разница между бес­цветным слоем эфира и окрашенной испытуемой жидкостью выступает очень отчетливо.

Незначительная модификация техники выполнения реакции позволяет установить количество и качество билирубина.

Появление окрашивания без добавления спирта рассматривается как прямая реакция, указывающая на билирубин, проведенный через печень. Положительная реакция после добавления спирта является непрямой и сви­детельствует о наличии билирубина, не проведенного через печень. Умноже­нием показателя разведения, в котором окрашивание едва намечается, на 0,016 устанавливают количество билирубина в 1 мл сыворотки, а последую­щим умножением на 100 — количество билирубина в миллиграмм-процентах.

Способ Казакова. В качестве реактива используется 20% раствор трихлоруксусной кислоты.

В чистых сухих вробЕрках (5—8 штук) разведение испытуемой сыворотки физиологическим раствором выполняется так же, как и по способу Бокаль­чука. В каждую пробирку вносят по 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. После перемешивания встряхиванием содержимое каждой ьробврки выливают в заранее приготовленные стеклянные воронки с фильтровальной бумагой. Воронки нумеруют, вставляют в штатив для пробирок и высуши­вают при комнатной температуре. Результат реакции учитывается на следую­щий день. Заметно различимое зеленое окрашивание считается концом реакции (табл. на стр. 328).

У крупного рогатого скота, овец, коз и свиней способами Бокальчука и Казакова билирубин выявляется только во второй половине беременности и не превышает 3,2 мг%. У лошадей содержание его достигает 6,4 мг%, л у жеребых кобыл — 12,8 мг% (Н. Н. Комарицын).

 

Для расчета можно воспользоваться следующей таблицей.

 

 

Количество билирубина в сыворотке значительно повышается при инфлюэнце, крупозной и гриппозной пневмонии, мыте. Наиболее высокие цифры (до 4 мг%) отмечаются при кровопятнистой болезни, отравлении SO₂ и хвощом. Максимальные изменения обнаружены при энцефаломиелите лошадей—8—12 мг%.

Значительные билирубинемии присущи небольшому числу заболеваний, имеющих совершенно различную клиническую картину; таким образом, этот показатель может быть с успехом использован при дифференциации процессов и для прогноза.

 

Определение кальция в крови

 

Кальций в сыворотке крови просто и удобно определяется методом де-Ваарда, для которого необходимы реактивы: 1) насыщенный водный раствор щавелевокислого аммония; 2) N /100 раствор марганцовокислого калия и 3) серная кислота.

В центрифужную пробирку наливают 2 мл прозрачной, хорошо отцен-трифугированной сыворотки и для осаждения кальция добавляют в нее 1 мл насыщенного раствора щавелевокислого аммония. Через 30 минут жидкость центрифугируют 10 минут на быстроходной центрифуге. Жидкость над осад­ком осторожно отсасывают, заменяют ее 5 мл дистиллированной воды и вновь центрифугируют. Промывание и центрифугирование повторяют 2—3 раза. Удалив последнюю воду, белый осадок смешивают с 5 мл серной кислоты, нагревают в водяной бане до 70—75° и титруют в горячем виде N/100 раство­ром марганцовокислого калия из микробюретки до появления розового окра­шивания.

1 мл титрованного раствора марганцовокислого калия соответствует 0,2 мг кальция. Если при титровании было израсходовано 1,1 мл раствора перманганата калия, то количество кальция в 2 мл сыворотки крови соот­ветствует 1,1x0,2=0,22 мг, а в 100 мл: 0,22 мгх50=11 мг%.

Используемая вода, несмотря на двойную перегонку, содержит некоторое количество кальция. Для исключения этого кальция в центрифужную про­бирку отмеривают 2 мл дважды дистиллированной воды и прибавляют 1 мл щавелевокислого аммония. Дальше повторяют те же манипуляции, что и при определении кальция в сыворотке крови. Количество марганцовокислого калия, израсходованного на титрование воды (без сыворотки), вычитают иа его же количества, потраченного при титровании исследуемой сыворотки. 44

Кальций сыворотки состоит из двух физиологически различных частей: диализирующей и недиализирующей. Последняя связана с белками сыво­ротки крови. Диализирующая часть составляет 45—55% общего кальция сыворотки; она, по всей вероятности, и является физиологически активной.

Введение кальция внутрь заметно не повышает количества его в сыворотке; однако при подкожном впрыскивании наступает резкое, но крат­ковременное повышение кальция в сыворотке крови.

Количество кальция в сыворотке крови повышается при деструктивных процессах в костной ткани, при гиперавитаминозе D; оно понижается при тетании, иногда при рахите, некоторых формах нефритов, родильном парезе, эксудативном плеврите, гангрене легких, кровопятнистой болезни, первичных и вторичных анемиях и некоторых других остро протекающих заболе­ваниях.

Колебания кальция зависят больше от тяжести патологического процесса и не подчинены этиологической природе заболевания.

У большинства здоровых животных количество кальция в сыворотке крови колеблется: у лошади от 9,0 до 21,0 мг% (в среднем 15,0 мг%), у козы от 23,0 до 26,0 мг% (в среднем 24,6 мг%).

 

Определение фосфора в крови

Фосфор содержится в липоидных и неорганических соединениях крови. В свежевзятой крови в течение первых трех часов хранения отмечается нарастание органической кислоторастворимой фракции фосфора за счет неорганической. Позднее органический кислоторастворимый фосфор подвер­гается гидролизу с образованием неорганической фракции. В гемолизирован-ной крови гидролиз совершается сразу и в значительном объеме.

Содержание фосфора определяют непосредственно после взятия крови, при котором принимают все меры предосторожности, предупреждающие ее гемолиз (сухая игла, сухая пробирка).

Метод Белл — Дойзи — Бриггса. В основу метода положен принцип превращения фосфора с помощью молибденовой кислоты в фосфорно-молибденовую кислоту, которая восстанавливается гидрохиноном и серно­кислым натрием в молибденовую синь. По степени окраски, устанавливаемой колориметрически, вычисляют количество неорганического фосфора. Для реакции используют: 1) 20% раствор трихлоруксусной кислоты.

2) 5% молибденовый раствор. 25,0 молибденовокислого аммония раство­ряют в 300 мл дистиллированной воды и вносят в мерную колбу емкостью 500 мл. Если нужно, раствор фильтруют. В другой колбе к 125 мл дистилли­рованной воды приливают 75 мл концентрированной серной кислоты. Второй раствор переливают в колбу с первым раствором, которую после охлаждения доливают водой до метки. Чтобы убедиться в отсутствии в реактивах фосфора, перед работой необходимо поставить пустой опыт (использование всех реак­тивов, но без крови).

3) 1 % раствор гидрохинона. На 100 мл раствора добавляют одну каплю концентрированной серной кислоты, чтобы замедлить окисление. Раствор должен быть почти прозрачным. При стоянии реактив становится коричневым и непригодным к употреблению.

4) Содово-сернистый раствор 25 мл 15% раствора сернокислого натрия смешивают со 100 мл 20% раствора углекислого натрия. Жидкость филь­труют. Раствор не стоек, а потому его готовят в небольших количествах (несколько определений).

5) Основной стандартный раствор. На аналитических весах отвешивают 4,394 г химически чистого фосфорнокислого калия, который предварительно высушивается в эксикаторе над сорной кислотой до постоянного веса. Навеску фосфорнокислого калия растворяют затем в 1 л воды. К готовому раствору прибавляют 5 мл хлороформа. Перед употреблением жидкость разводят в 100 раз. 1 мл рабочего стандартного раствора содержит 0,01 мг фосфора.

6) Беззольные фильтры.

Техника определения. 1 мл только что взятой, еще не свернувшейся крови вносят в пробирку с 3 мл воды, ополаскивают пипетку той же водой и добав­ляют к смеси 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. Содержимое взбалтывают и, дав ему постоять 10 минут, фильтруют через беззольный фильтр. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен и бесцветен. Затем в одну из двух одинаковых градуированных пробирок отмеривают 1,5 мл фильтрата, а в другую такое же количество стандартного раствора и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. По возможности одновременно в обе пробирки добавляют 0,5 мл 5% раствора молибденовокислого аммония и 0,5 мл 1% раствора гидрохинона. Жидкость темнеет. Спустя 5 минут в пробирки приливают 1 мл содово-сернистого раствора (приливают медленно, так как обра­зуется пена) и воду до 6 мл. Через 10 минут приступают к колориметриро-ванию.

При колориметрировании в колориметре Дюбоска расчет ведут по сле­дующей формуле:

где К — концентрация; В — высота столба жидкости при измерении (следует учесть, что 1,5 мл фильтрата равны 0,3 мл крови).

В качестве редуцирующего вещества можно использовать 1 % раствор аскорбиновой кислоты, приготовленный на N/10 HC1.

Реакцию ставят следующим образом. После внесения молибденового реактива добавляют 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Одновременно обрабатывают и стандарт. Появляющееся синее окрашивание достигает мак­симальной интенсивности через 10 минут. В завершение производят колори-метрирование и вычисляют содержание фосфора по обычным правилам.

Определение фосфора в крови или сыворотке имеет большое клиническое значение. На содержание его в крови значительное влияние оказывает каче­ство корма (установлено, что летом количество фосфора в крови несколько больше, чем зимой).

Уменьшение количества фосфора против нормы наблюдается при рахите и родственной последнему остеомаляции. При лечении рахита рыбьим жиром или препаратами витамина D содержание фосфора в крови возрастает, что можно использовать для контроля терапии.

Увеличение количества фосфора отмечается при почечной недостаточ­ности, а также в период заживления костных переломов.

Содержание фосфора в липоидах сыворотки увеличивается при диабете, патологической беременности и при нарушении функции печени.

У здоровых животных количество неорганического фосфора колеблется от 5,0 до 9,0 мг% (в среднем равно 7,0 мг%).