Источники ошибок при реакции изоагглютинации

Вопрос об ошибках при реакции изоагглютинации является чрезвычайно важным и требует всестороннего рассмотрения.

Ошибки могут быть двух родов: а) неправильные положительные результаты, когда агглютинация признается там, где ее в действительности нет, и б) неправильные отрицательные результаты, когда истинная изоагглютинация не замечается или не получается там, где она должна быть.

Причиной ложной агглютинации может быть следующее.

1 Панагглютинирующая наклонность сыворотки, которую устраняют тщательным контролем и отбором сывороток. Для проверки служит параллельная реакция с эритроцитами группы 0, разведение солевым раствором и в случае дальнейших сомнении нагревание до 22-25°. Истинная изоагглютинация в этом случае остается, ложная исчезает.

2 Пониженная температура (ниже 10°). Реакцию следует производить при температуре не ниже 12°, а лучше даже несколько выше.

3 Сгущенная сыворотка или высыхание капли делает смесь более вязкой и вызывает неспецифическое склеивание эритроцитов. Сгущение сыворотки возможно при стоянии ее в открытых сосудах, а также в капле на стекле или тарелке в жаркую сухую погоду.

4 Повышенная кислотность среды, вследствие чего надо тщательно избегать всего, что может усилить кислотность сыворотки и растворов, применяемых для реакции.

5 Несвежие взвеси эритроцитов иногда дают неспецифическую реакцию чаще всего из-за бактериального загрязнения (феномен Томсена). Поэтому всегда надо применять свежие эритроциты.

Истинную агглютинацию могут затормозить следующие причины.

1 Повышенная температура - выше 30°, почему реакция всегда должна производиться при более низкой температуре. Оптимальная температура - комнатная (15-18°). В жарких местностях, если температура помещения не может быть искусственно понижена, реакцию приходится производить рано утром или вечером, когда температура воздуха понизится естественно.

2. Слабый титр, дефективность или потеря активности сыворотки. Этот источник ошибок устраняют тщательным отбором, правильным изготовлением и контролем сывороток. Если группа определяется в самой сыворотке или плазме, этот источник ошибок всегда может иметь место, и тогда может помочь только тщательность производства и наблюдения реакции.

3. Чрезмерное количество эритроцитов. Это особенно частая погрешность при работе по капельному методу. Если взять много крови, часть агглютининов сыворотки нейтрализуется ее агглютиногенами, другая часть абсорбируется эритроцитами, и для реакции может не остаться избытка. Поэтому следует тщательно придерживаться правила: брать крови в 10-15 раз меньше сыворотки.

4. Недостаточную продолжительность наблюдения устраняют правильным подбором сывороток и тщательным соблюдением правил производства реакции, исключающих всякую торопливость.

5. Слабая чувствительность эритроцитов (малая агглютинабильность). Это особенно относится к подгруппам А₂ и А₂В, поэтому необходимо отбирать более сильные сыворотки группы В и проверять их не только по эритроцитам А₁, но и по эритроцитам А2. Особенно слабо бывает выражено свойство А₂ в соединении с В, т. е. в подгруппе А₂В, почему такую группу АВ ошибочно принимают за группу В. При одном агглютиногене А₂ вместо группы А слабой сывороткой В и 0 может быть ошибочно определена группа 0. Действительно, подобные неверные определения как раз встречаются чаще других ошибок.

6. Изогемолиз, который иногда быстро развивается и не дает агглютинации выявиться, что может иметь значение при определении группы в сыворотке или плазме. Изогемолиз устраняется инактивацией - нагреванием до 56° в течение 30 минут.

Помимо всего указанного, любая ошибка может произойти вследствие неправильного обозначения или перепутывания стандартных сывороток и эритроцитов, что можно устранить только внимательным отношением к делу во всех его стадиях и тщательным соблюдением всех рекомендуемых мер предосторожности.

Определение подгрупп А₁ и А₂

Такое определение может быть произведено только после того, как определена основная группа (А или АВ). Правда, иногда по слабости и медленности основной реакции можно предположить о наличии подгруппы А₂ или А₂В, но все же надежных методов для быстрого определения подгруппы «сразу» нет. Чтобы определить подгруппу, надо иметь специальную сыворотку. Наилучший способ ее получения - это абсорбирование сыворотки В эритроцитами подгруппы А₂, которые поглощают излишек а-агглютинина, необходимый для агглютинирования эритроцитов А₂. После центрифугирования сыворотка отсасывается и служит для определения подгрупп. Такая сыворотка называется анти-А₁, так как агглютинирует только эритроциты A₁. Отсутствие агглютинации означает, что кровь группы А или АВ принадлежит к подгруппе А₂ или соответственно А₂В. Этот способ следует считать наилучшим, но для него необходимо иметь точно установленного и проверенного донора подгруппы А₂.

 

ИНСТРУКЦИЯ

работы с картами «DiaClon ABO/D+reverse grouping»

(карты для определения группы крови по системам АВО перекрестной реакцией и резус-фактора), каталожный номер 001234 с моноклональными антителами

В данных картах ДиаМед находится 6 микропробирок, заполненных гелем.

Состав:

- в первых трех микропробирках «А», «В» и «D» содержится гель с антисыворотками и они предназначены для определения антигенов А, В, и резус-фактора (D).

- ctl – контроль качества карт (всегда должен быть отрицательный, т.е. без агглютинации)

- в последних двух микропробирках «А₁» и «В» содержится нейтральный гель, в которые необходимо добавить стандартные эритроциты.

Предназначены для перекрестной реакции – определения естественных антител анти-А и анти-В.

Рис. 1 Карта ДиаМед

 

Работа с картами.

1. Включить центрифугу.
2. Подготовить отцентрифугированную кровь, без сгустка.
3. Промаркировать карту (ФИО пациента или номер пробирки с кровью).
4. Снять фольгу со всех микропробирок.
5. Пробы вносить пипеткой на край пробирки, не затрагивая гель.
6. Внести по 50 мкл (по 1 капле из пипетки фо флакончиках) стандартных эритроцитов (каталожный номер 003624) из флакончиков анти-А и анти-В в последние две микропробирки.
7. Внести по 50 мкл сыворотки или плазмы в эти же микропробирки.
8. Внести в простую пробирку на 5-10 мл (центрифужная, любая стеклянная, пластиковая) 500 мкл раствора ID-Diluent (каталожный номер 009260) и добавить 50 мкл цельной крови (или 25 мкл эритроцитарной массы). Это рабочая суспензия.
9. Рабочую суспензию по 12,5 мкл внести в первые 4 микропробирки.
10. Карты поставить в центрифугу, уравновесить, если есть необходимость (например, одна карта), нажать на «старт».
11. Центрифугирование длится 10 мин и после автоматического отключения необходимо оценить степень агглютинации в геле.

 

Интерпретация результатов.

При наличии антигена А, В, D на эритроцитах на поверхности геля образуются агглютинаты, т.к. не проходят через гель из-за большого размера (положительный результат).

При отсутствии антигена в исследуемом образце эритроциты не образуют агглютинатов с антисывороткой, при центрифугировании легко проходят через гель и оседают на дне.

На рис. 1 в нижних ячейках обозначена степень агглютинации от 1 до 4. В основном данные ячейки заполняются «+» или «-»в связи с тем, что степень агглютинации в клинике не важна.

 

I группа	II группа	II группа	IV группа
Отсутствуют антигены А и В, присутствуют естественные антитела анти-А и анти-В.     В первых двух микропробирких «А» и «В» агглютинаты на дне микропробирки. В последних двух микропробирках анти А1 и анти В агглютинаты остаются на поверхности геля	Есть антиген А, отсутствует антиген В, естественные антитела анти-А отсутствую, анти-В присутствуют.   В микропробирке «А» агглютинаты наверху, в «В» - внизу. В последних анти А1 – внизу, анти-В - наверху	Есть антиген В, отсутствует антиген А, естественные антитела анти-А присутствую, анти-В отсутствуют. В микропробирке «А» агглютинаты внизу, в «В» - наверху. В последних анти А1 – наверху, анти-В - внизу	Есть антиген А и антиген В, естественные антитела анти-А и анти-В отсутствуют.     В первых микропробирках «А» и «В» агглютинаты наверху. В последних микропробирках анти А1 и анти-В - агглютинаты внизу

А В D ctl A₁ B А В D ctl A₁ B А В D ctl A₁ B А В D ctl A₁ B

- - + - + + -+ - + - - + - + + - + - + + + - - -

Рис. 1 Степени агглютинации

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ФАКТОРА