Технологія роботи з ембріонами

Зібрану в скляний циліндр під час вимивання ембріонів промивну рідину накри­вають алюмінієвою фольгою, передають у стерильний бокс, де ставлять на півгоди­ни в термостат для відстоювання. Для уникнення забруднення промивної рідини та ембріонів у багатьох зарубіжних центрах всі маніпуляції з ембріонами проводять під ламінарною течією відфільтрованого повітря у спеціальних шафах, де низхідні течії стерильного повітря перешкоджають проникненню мікрофлори.

Після відстоювання промивної рідни відсмоктують за допомогою сифону її верх­ній шар, а залишених на дні 50-100 мл розливають обережно по 20-30 мл у чашки Петрі, дно яких для зручності розкреслено на квадрати, розміром 1 х 1 см, і досліджу­ють під стереоскопічним мікроскопом (МБС-9) чи бінокулярною лупою при 15-25- кратному збільшенні.

Досліджуючи уважно промивну рідину під мікроскопом, намагаються перш за все "виловити" в ній усі ембріони та незапліднені яйцеклітини і перенести їх у маленьку чашку Петрі для детальної оцінки і дальшої роботи з ними.

Оцінюючи стан кожного ембріона, звертають увагу на: відповідність стадії роз­витку ембріона його віку; форму прозо­рої оболонки та її цілість; рівномірність дроблення бластомерів; стан цитоплазми; прозорість перивітелінового простору.

Біологічно повноцінні ембріони мають чітку кулясту форму, прозору гомогенну цитоплазму, непошкоджену прозору обо­лонку, однакового розміру бластомери з щільним міжклітинним комплексом. Емб­ріони, що містять різних розмірів бласто­мери з нечіткими клітинними мембранами та іншими ознаками дегенерації, вважа­ються неповноцінними.

Рис. 46. Ранні стадії розвитку ембріона ве­ликої рогатої худоби:

1) незапліднена яйцеклітина та спермій (ПО - прозора оболонка, Ж - жовткова оболонка, 1ПТ - перше напрямне тільце, С - спермій); 2) зигота, 1-й день розвитку (ПВП - перивітеліновий простір); 3) 2-й день, ембріон на стадії 2-х бластомерів (Б); 4) 2-3-й день, 4-клітинна стадія роз­витку ембріона; 5) 3-4-й день, 8-клітинна стадія; 6) 5-6-й день, морула; 7) 6-7-й день, рання бластоциста (ПБ - по­рожнина бластоцисти); 8) 7-8-й день, експандована блас­тоциста (Е - ембріобласт, Тр - трофобласт); 9) 8-9-й день, бластоциста на стадії вилуплення; 10) 9—11-й день, вилуплена бластоциста; 11) 12-й день, пізня бластоциста; 12) 14-й день, видовжений бластодермічний міхурець.

Вище наводились основні риси ембріона на ранніх стадіях його розвитку. Ці риси слід чітко пам'ятати і по них оцінювати "вік" ембріона, його повноцінність. При ви­миванні ембріонів з яйцепроводів практично всі вони бувають на стадії ранньої мору- ли, тоді як при вимиванні ембріонів з рога матки більшість з них буває на стадії ран­ньої бластоцисти. Внаслідок деякої розтягнутості суперовуляції тут можуть зустріча­тися і морули, і пізні бластоцисти, і незапліднені яйцеклітини в стані дегенерації (зі зморщеною, нерівної форми цитоплазмою), і, нарешті, зародки неправильної форми, з порушеннями цілості прозорої оболонки, її розривами, розшаруваннями, стисненою порожниною, нерівномірним дробленням, порушеннями міжклітинних зв'язків, гра­нуляцією протоплазми. Відправною рискою при оцінюванні ембріонів є день циклу, на який проводиться вимивання, і типічні для даного "віку" риси ембріона.

Ембріони, що різко відстали у своєму розвитку, з вираженими ознаками асинхрон- ності дроблення бластомерів, їх дегенерації непридатні для трансплантації, тоді як ембріони з незначними морфологічними змінами вважаються умовно придатними.

Значно більші зміни спостерігаються у збережених у замороженому стані ембріо­нів, тому оцінка їх буває важчою.

Існує декілька підходів до оцінки ембріонів. Греве пропонує оцінювати їх за таки­ми показниками: життєздатні - ембріони, стадія розвитку яких співпадає з їх віком, що відраховується, починаючи з дня осіменіння; сповільнені (ретардовані) - ембріо­ни, які виявляються на дещо ранніх стадіях розвитку, ніж очікувалося в зв'язку з їх віком; вироджені (дегенеровані) - ембріони з різними ознаками дегенерації.

Райт класифікує ембріони за морфологічними ознаками на: нормальні; ембріони з незначними відхиленнями; ембріони із збільшеною кількістю дегенерованих клітин.

М. І. Сергєєв та Ф. І. Осташко запропонували 5-бальну систему оцінки ембріонів за морфологічними ознаками.

Проте на підставі морфологічної оцінки ембріонів важко зробити висновок про їх життєздатність. Все залежить від їх розвитку в процесі культивування і від при­живлення їх в розі матки. На жаль, точніших, а головне - доступних для виробництва методів поки що немає.

В сумнівних випадках можна залишити вимиті ембріони в невеликій кількості по­живного середовища на 30-40 хв. в термостаті для діагностичного культивування.

Короткотермінове збереження та культивування ембріонів. Від видобування ембріонів у донорів до пересаджування їх реципієнту проходить звичайно не менше 3 годин. Протягом цього часу потрібно зберегти життєздатність ембріонів.

Для цього ембріон можна помістити в 0,5 мл середовища на годинниковому скель­ці, поставити його в стерильну чашку Петрі, дно якої вистелене вологим фільтруваль­ним папером, накрити і поставити в термостат з температурою 37 °С.

Для більш тривалого зберігання ембріона (у відповідному середовищі в ампулах, поліхлорвінілових пайетах для осіменіння) засмоктують ембріон в пайету таким чи­ном, щоб з обох боків його утворилися повітряні пухирці довжиною 1-1,5 см. Закри­вають кінці пайети стальними кульками чи поліетиленовими корками і поміщають в термостат при 37 °С чи під шаром стерильного вазелінового масла на годинниковому склі чи у пробірці.

В таких умовах біологічно повноцінні ембріони можуть зберігатися до 24-48 го­дин, але в практичних умовах культивування при 37 °С застосовують лише як виму­шений короткочасний захід.

В кінці культивування обов'язково перевіряють під мікроскопом життєздатність ембріонів.

Одним з прикладів успішного зберігання ембріонів при температурі тіла є досліди кембріджських вчених по пересаджуванню ембріонів овець у яйцепроводи кролиці, які дозволили здійснити ряд міжконтинентальних перевезень ембріонів з послідую- чою їх ретрансплантацією. Після хірургічного пересаджування таких ембріонів отри­мано нормальних нащадків.

Можна також зберігати ембріони при знижених плюсових температурах, що ви­кликають зворотне гальмування метаболічних процесів.

Кріоконсервування ембріонів. Ще в 1953 р. О. Сміт вперше вдалося заморозити ембріони кролика, проте для перенесення цих дослідів на сільськогосподарські тва­рини потрібно було біля 20 років.

Оптимальною стадією для заморожування ембріонів великої рогатої худоби є ран­ня бластоциста, овець і кіз - пізня морула чи рання бластоциста, свиней - бластоцис­та; краще переносять заморожування свіжі ембріони.

Заморожування та розморожування ембріонів може супроводжуватися кристалі­зацією води в бластомерах та концентрацією розчинених речовин у рідкій фазі. Ці два процеси можуть проявлятися одночасно, хоча кристалізація більш виражена при відносно швидкому, а осмотичні зміни - при повільному заморожуванні.

Слід підкреслити, що процес заморожування ембріонів є набагато складнішим від заморожування сперми, оскільки ембріони є багатоклітинними утвореннями. Тому дуже важлива роль відводиться підготовці ембріонів до заморожування, їх захисту від температурних та осмотичних пошкоджень.

В процесі заморожування ембріонів спочатку знижується температура в навколо- клітинному середовищі, тут поступово збільшується кількість льоду, тоді як в решті розчину зростає концентрація солей.

Виникає таким чином різниця осмотичного тиску між позаклітинною та внутріш­ньо-клітинною фазами, яка може бути зрівноважена шляхом віддачі клітинами води в позаклітинне середовище.

Для уникнення кристалізації внутрішньоклітинної води до складу середовища до­дають кріопротектори диметилсульфоксид (ДМСО) чи гліцерин, а щоб не допустити осмотичних зрушень - штучно стимулюють кристалізацію на певній стадії. Проте саме введення до складу середовища з ембріонами кріопротектора, як і його видален­ня, може викликати осмотичні зрушення. Тому, це насичення (еквілібрацію) роблять поступово, поміщаючи ембріони на годинникових стеклах в чашках Петрі спочатку на 5-10-хв. у 0,25 М розчин ДМСО, тоді - в 0,5 М, 1,0 М і нарешті - 1,5 М розчин.

В останньому розчині ембріони витримують 15-20 хвилин. Якщо кріопротектором служить гліцерин, то спочатку ембріони поміщають на 10 хв. у 3,3 %-ий його розчин, тоді на 14 хв. у 6,6 %-ий і в кінці на 30 хв. у 10 %-ий розчин. Після розморожування ембріонів їх також відмивають від кріопротектора, переносячи поступово з розчинів з більшою концентрацією кріопротектора в менш концентровані розчини.

Закінчивши насичення ембріонів кріопротектором їх розфасовують по пробірках, ампулах чи пайетах для заморожування, яке проводять одно- чи двоетапним методом, повільно чи швидко. В пайети ембріони поміщають в такій послідовності: середови­ще - повітря - середовище з ембріоном - повітря - середовище. Кожен стовпчик по­винен займати в пайеті біля 1-2 см довжини. Один край пайети закривають зволоже­ним корком.

Для зниження перепаду температур і уникнення осмотичних змін, за 4-5 °С до початку льодоутворення стимулюють кристалізацію, додаючи до розчину зернину льоду, кристалик йодистого срібла чи просто переохолоджений предмет (проколюють фольгу пінцетом з намерзлою на кінці краплею середовища і швидко торкаються ним поверхні рідини).

Повільне заморожування і повільне розморожування ембріонів. Охолоджу­ють ембріони від 20 °С до -7 °С зі швидкістю 1 °С/хв., викликають кристалізацію і тоді охолоджують зі швидкістю 0,3 °С/хв. до -36 °С далі - зі швидкістю 0,1 °С/хв. до -60 °С і переносять в рідкий азот.

Розморожують ембріони в спиртовій бані - скляній циліндричній колбі з температу­рою -50 °С, куди поміщають пробірки чи ампули з ембріонами і розморожують зі швид­кістю 4 °С/хв. до 10 °С, після чого переносять на 5 хв. у водяну баню з температурою 20 °С. Нарешті, переносять ембріони в середовище для видалення кріопротектора.

Швидке заморожування та розморожування ембріонів. Охолоджують ембрі­они у міні-пайетах - від 20 °С до 7 °С зі швидкістю 1 °С/хв., викликають кристаліза­цію і тоді охолоджують зі швидкістю 0,3 °С/хв. лише до -30 °С і переносять в рідкий азот. Розморожують ембріони у водяній бані з температурою 37 °С протягом 30 сек. зі швидкістю 3,0 °С/хв.

НДІ тваринництва Лісостепу і Полісся УРСР запропонував свою технологію за­морожування ембріонів: свіжовимиті ембріони переносять на 10 хв. в 0,5 М розчин ДМСО на середовищі ФБС, тоді на 20 хв. в таке ж середовище з 1,3 М ДМСО, після чого, по 3-4 зародки переносять в уленгутівську пробірку з 0,5 мл 1,0 М ДМСО на ФБС, герметизують пробірку і поміщають у програмний апарат для охолодження і заморожування.

Заморожування ведуть за такою програмою: від 22-25 °С до 6 °С зі швидкістю 1 °С/хв., штучно збуджують кристалізацію середовища і заморожують від -7 °С до -40 °С зі швидкістю 0,3 °С/хв., від -40 °С до -60 ° С - зі швидкістю 0,1 °С/хв., після чого переносять пробірки з охолодженими до -60 °С ембріонами в рідкий азот.

Останнім часом запропоновані технології заморожування ембріонів у соломин­ках, які містять одночасно два середовища - для заморожування (рідина Дюльбекко з 10 %-им гліцерином і поміщеним в ній ембріоном) і середовище для розморожування (рідина Дюльбекко з 20 % фетальної сироватки і 0,5 М розчином сахарози). Після розморожування соломинку струшують (для змішування середовищ), витримають на 10-20 хв. при кімнатній температурі і пересаджують ембріон реципієнту.

При заморожуванні ембріонів необхідно суворо дотримуватися технології. За­морожування ембріонів дозволяє значно вдосконалити організацію трансплантації і відпадає потреба утримання великої кількості реципієнтів і термінового пересаджу­вання вимитих ембріонів. Замість цього можна створювати банки ембріонів, прово­дити трансплантацію розморожених ембріонів реципієнтам після спонтанної охоти, проводити їх експорт та імпорт.

Пересаджування ембріонів

До середини 70-х років пересаджування ембріонів робили в основному хірургіч­ними методами, тоді поступово стали запроваджувати нехірургічні методи. Як перші, так і другі мають свої позитивні та негативні властивості.

Хірургічний метод вимагає хірургічних навичок, спеціального приміщення, від­повідного обладнання та інструментів; він дозволяє вводити ембріони глибоко в ріг матки, що не вдається при нехірургічному пересаджуванні. До того ж в останньому випадку необхідно пройти спеціальним інструментом крізь родові шляхи геть аж до середини рога матки. Шийка матки в цей період буває закритою, а її слизова оболонка легко травмується; в геніталії може заноситися мікрофлора.

Для полегшення введення інструментів іноді застосовують препарати, що заспо­коюють тварин та розслабляють шийку матки.

Ефективність пересаджування ембріонів залежить перш за все від синхронності охоти у донорів і реципієнтів, оскільки стан ендометрію повинен відповідати "віко­вим" змінам ембріона.

Хірургічне пересаджування ембріонів. Хірургічний метод пересаджування ембріонів належить до порожнинних операцій, тому проводити його необхідно в операційній, обладнаній універсальним фіксаційним станком чи операційним сто­лом. Лапаротомію проводять по білій лінії черева під загальним наркозом при спин­ному положенні тварини або в області голодної ямки під місцевою анестезією на стоячій тварині.

Для пересаджування ембріонів можна користуватися модифікованою пастерів­ською піпеткою з лійкоподібним розширенням на кінці капіляру та герметичною гумовою насадкою на протилежному кінці, приладом Кассу для штучного осіме- ніння, за допомогою пайет, російських або французьких звичайних чи телескопіч­них катетерів.

Застосовувані інструменти повинні бути чистими і стерильними.

Заправляють пайети ембріонами так же, як для заморожування, тобто спочатку набирають стовпчик середовища Дюльбекко довжиною 1,5-2 см, тоді такий же стовп­чик повітря, далі засмоктують ембріон разом з середовищем, знову стовпчик повітря і нарешті стовпчик середовища.

Одягають на піпетку стерильний поліетиленовий чохол чи накривають її стериль­ною серветкою і зберігають в боксі в горизонтальному положенні до пересаджування.

Підготовка тварини до операції і оперативні доступи до матки такі ж, як при ви­миванні ембріонів. При лапаротомії по білій лінії живота знаходять в черевній порож­нині яєчник з активним жовтим тілом; виводять за маткову зв'язку іпсілатеральний ріг матки назовні (в момент розслаблення) і тупою голкою (діаметром 1-1,5 мм) чи мо­лочним катетером проколюють ріг матки приблизно в 5 см від матково-трубного з'єд­нання. Вводять в утворений отвір капіляр-піпетки з ембріоном в напрямку верхівки рога матки ближче до його матково-трубного з'єднання і зіштовхують вміст піпетки у просвіт рога матки, на його слизову оболонку. Таким же чином переносять другий ембріон в другий ріг матки. При цьому не можна торкатися стінок рога матки.

Щоб переконатися, що ембріони пересаджено в матку, перевіряють використані піпетки під мікроскопом.

Закінчивши пересаджування, перевіряють, чи зайняла матка вихідне положення і вводять у черевну порожнину 250 мл фізрозчину з антибіотиками (по 500 тис. ОД пеніциліну та стрептоміцину в 50 мл новокаїну). Накладають триповерховий шов і залишають реципієнта під наглядом протягом двох тижнів.

Пересаджування ембріонів через розріз черевної стінки в області правої чи лівої голодної ямки значно простіше і менш трудомістке. Готують реципієнта до операції і здійснюють операційний доступ так же, як при вимиванні ембріонів цим методом.

Відкривши доступ до внутрішніх органів, вводять через розріз руку в черевну порожнину, захоплюють великим та вказівним пальцями маткову зв'язку протилеж­ного рога матки, виводять його назовні, пересаджують в його просвіт ембріон (як в попередньому випадку), тоді аплікують ембріон в другий ріг матки. Опускають матку на місце, вводять в черевну порожнину антибіотики, накладають тришаровий шов та клейову пов'язку. Тварина залишається під наглядом протягом двох тижнів, після чого знімають шви.

Ефективність хірургічного пересаджування ембріонів висока, біля 60 %, тому не випадково в багатьох зарубіжних центрах користуються переважно цим методом з лапаротомією в області голодної ямки.

Правда нанесення тварині травми внаслідок резекції м'язів, неможливість багато­разового використання тварини, складності самої операції стримують широке засто­сування цього методу.

Нехірургічне пересаджування ембріонів. Перші досліди по нехірургічному пере­саджуванню ембріонів проведено на початку 60-х років. Застосовувані сьогодні ін­струменти складаються в основному з металевого катетера та довгої капілярної труб­ки, в передній частині якої є приставка для поміщення ембріона в невеликій кількості середовища.

Якщо пересаджування здійсню­ють за допомогою гнучкого приладу Касу, то ембріон необхідно помістити в пайету (як вказано вище), вставити пайету в наконечник приладу, з'єд­нати його з основною трубкою. При

^вик°р^{истанні п}р^иладу ^{ВІТ емб}р^{іон в} Р_ИС. ₄₇. Пересаджування ембріонів.

такій же послідовності поміщають в -------------------------------------------------------------

кінцеву пластикову частину катетера.

Підготовку тварини до нехірургічного пересаджування ембріонів проводять так же, як до нехірургічного вимивання ембріонів - фіксують у станку, наводять туа­лет перинеальної області, роблять сакральну анестезію 2 %-им розчином новокаїну, (5 мл), сильнозбудливим тваринам вводять також міорелаксант комбелен (0,5 мл).

Беруть у праву руку відповідним чином підготований і заправлений ембріоном катетер і вводять його по верхньому склепінню піхви до шийки матки. Накривають зовнішню частину приладу серветкою (або ж одягають на інструмент гінекологіч­ну рукавицю) і вводять ліву руку в пряму кишку. Промацують матку, визначають в якому яєчнику є жовте тіло і скеровують наконечник катетера в цервікальний канал. Переконавшись, що катетер введено в шийку матки, обережно натягують її на катетер і проштовхують його в іпсілатеральний ріг матки. Обережними рухами просувають катетер як можна ближче до верхівки рога матки, постійно контролюючи ректально місце знаходження голівки катетера.

Пересвідчившись у вірності введення інструмента, подають команду помічнику ввести вмістиме катетера в матку. Після цього обережними рухами виймають катетер і передають його на обробку.

Аналогічним чином можна ввести інший катетер в другий ріг матки і зробити так зване білатеральне (двостороннє) пересаджування ембріонів, хоча приживлення їх в контрлатеральному розі буває дещо нижчим. М. І. Сергєєв отримував при таких пере­саджуваннях 55-60 % народжень двійнятами.

На перший погляд пересаджування ембріонів дещо нагадує цервікальне осіменін- ня корів з ректальною фіксацією шийки матки. Фактично ж вона значно складніша. Якщо під час осіменіння шийка матки буває відкритою, а цервікальний слиз воло­діє високими бактерицидними властивостями, то під час пересаджування ембріонів шийка матки буває закритою, порожнина матки - стерильна, слизові оболонки гені­талій легко травмуються, бактерицидні властивості маткового секрету знижені. Все це необхідно враховувати при роботі, звертаючи особливу увагу на асептику та анти­септику і, безумовно, на майстерність роботи.

Слід також пам'ятати, що резистентність геніталій в лютеїнову фазу буває зниже­ною, а чутливість ендометрію до інфекції - підвищеною, тому бактеріальна інфекція, яка може проникнути в матку при пересаджуванні зародків, є другою за своєю важли­вістю причиною низької результативності трансплантації ембріонів.

Третім моментом частих невдач є травмування ендометрію інструментами. Кро­вовиливи, що при цьому виникають, негативно впливають на виживання ембріонів, оскільки непрогріта кров є ембріонотоксичною.

Не рекомендується протягом двох місяців після пересаджування вакцинувати, пе­регруповувати чи піддавати іншим стресовим впливам реципієнтів. Через 60-73 днів після пересаджування ембріонів реципієнтів досліджують на вагітність.

Трансплантація ембріонів у інших видів тварин.

Розроблені методи трансплантації ембріонів і для інших видів тварин, правда поки що вони мають більш наукове, ніж прикладне значення.

У овець добування та пересаджування ембріонів проводять лише хірургічним ме­тодом, під загальним чи місцевим наркозом. Р. Аверіл з співробітниками в 1957 р. вперше застосували метод інкубації зигот вівці в організмі кролиці. Вони пересадили семи кролицям 18 овечих ембріонів на стадії 2-х-12-ти бластомерів. Через 4-5 днів кролиць забили і з порожнини матки вимили 9 морул та бластоцист. Дві бластоцисти пересадили вівцематці, у якої овуляція мала місце 6 днів раніше. Через 16 днів її за­били і виявили в рогах матки два нормально розвинені ембріони.

6 квітня 1961 року в англійській газеті "Дейлі експрес" повідомлялося про ори­гінальний дослід, проведений С. Адамсом та Л. Роусоном. Автори пересадили овечі ембріони в яйцепроводи кролиці, яку опісля перевезли в Наталь на віддаль 6 000 миль і отримали після пересаджування приплід (до цього, в 1954 р. М. Ченг та В. Мар- ден перевозили авіапоштою в посудині Дьюара в сироватці крові ембріони кролика із США в Кембрідж і отримали після трансплантації двох кроленят). В 1965 р. в АН Казахстану під керівництвом академіка Ф. М. Мухамедгалієва проведено широкопла- нові дослідження по трансплантації ембріонів овець.

В досліді по трансплантації ембріонів, отриманих внаслідок суперовуляції, із яй­цепроводів однієї вівцематки вдалося видобути до 14-ти ембріонів на стадії 2-х-8-ми бластомерів. Восени 1975 р. внаслідок трансплантації таких ембріонів від вівцематки № 1757/9891 породи Лінкольн отримано 9 ягнят - в т. ч. 5 баранчиків. Вирощені ба- рани-трансплантанти в 1976-1979 рр. були використані для осіменіння овець. В ре­зультаті отримано 6 850 ягнят, в тому числі отара ярок (3 000). Таким чином, від овець породи Лінкольн, які важко акліматизувалися в умовах Казахстану, отримало велику кількість баранів-плідників і створено стадо кросбредних овець.

Що ж стосується гормонального викликання багатоплідної вагітності у овець, то воно не доцільне, оскільки при цьому зростає смертність приплоду.

Першу трансплантацію ембріонів у свиней здійсняв О. В. Квасницький, переса­дивши 9 ембріонів, добутих з яйцепроводів миргородської свині, свиноматці великої білої породи і отримав 4-х поросят-трансплантатів. В 60-70-х роках вдосконалено методику ембріопересаджувань, проведено досліди по міжконтинентальному пере­везенню ембріонів свиней з Канади у Великобританію (Вратали та ін.) та із США в Іспанію (Джеймс і Рісер) і Великобританію (Джеймс з співробітниками).

Вимивання та пересаджування ембріонів проводять хірургічним методом через 1-3 дня після осіменіння, головним чином з метою підвищення ефективності вико­ристання генетичного потенціалу елітних свиней, інтродукції нових тварин в замкну­тих стадах, отримання нащадків від неплідних елітних свиноматок та в карантинних стадах. Оптимальним вважається перенесення 12-18-ти ембріонів одному реципієн­ту. Свиноматки не здатні виношувати більше плодів, ніж відбулося овуляцій. При пе­ресаджуванні менше 4-х ембріонів вагітність не зберігається.

Складність трансплантації ембріонів у кобил полягає в тому, що у них важко ви­кликати суперовуляцію за допомогою екзогенних гонадотропінів. Тому збільшення кількості приплоду від цінних кобил за допомогою трансплантації можна досягну­ти шляхом багаторазового отримання поодиноких ембріонів нехірургічним методом. Розповсюдження методу в конярстві обмежується також асоціацією з реєстрації по­родних коней, яка довший час не визнавала нащадків, отриманих шляхом штучного осіменіння чи трансплантації ембріонів.