Розрідження і зберігання сперми

Розрідження (розбавлення) сперми. Спермії, які утворюються у звивистих ка- наликах сім'яників самців, скупчуються у придатках сім'яників, де можуть зберігати тривалий час свою життєвість у стані анабіозу. Цьому сприяє високий вміст тут йонів водню, калію та вугільної кислоти, низька концентрація кисню, гліколізованих цу­крів, інтенсивне видалення з током крові продуктів обміну та знижена температура у порожнині калитки.

Під час еякуляції спермії змішуються з секретами додаткових статевих залоз, ви­ходять зі стану анабіозу і починають енергійно рухатися. Це приводить до швидкого витрачання поживних речовин і нагромадження шкідливих продуктів обміну. Наявні у секретах додаткових статевих залоз хлористі солі натрію та калію сприяють на­буханню та сповзанню ліпопротеїдного покриву сперміїв, зниженню, а то й втраті ними електричного заряду, що врешті обумовлює спочатку зірчасту їх аглютинацію (склеювання голівками), а потім - масову коагуляцію. Крім того, нерозріджена спер­ма чутлива до різких коливань температури. Нарешті, у процесі еякуляції сперма за­бруднюється мікроорганізмами, які негативно впливають на живучість та заплідню­ючу здатність сперміїв.

Проведені ще у тридцятих роках ХХ ст. дослідження показали, що виживання сперміїв поза організмом можна збільшити шляхом сповільнення їх рухливості, зни­ження інтенсивності у них обмінних процесів, ослаблення несприятливої дії на спер­мії секретів додаткових статевих залоз і мікроорганізмів.

Досягти цього можна шляхом розрідження сперми та відповідного режиму її зберігання.

При розрідженні сперми переслідують таку мету: зменшити концентрацію у спер­мі та ослабити несприятливу дію на спермії шкідливих речовин; створити середови­ще, яке захищає спермії від холодового удару та мікробного забруднення; збільши­ти об'єм використовуваної сперми і за рахунок цього - інтенсивність використання плідників; створити оптимальні умови для виживання та зберігання запліднюючої здатності сперміїв на більш тривалий час.

Виходячи з цього, розріджувач повинен відповідати таким вимогам:

> бути ізотонічним зі сперміями даного виду тварин і підтримувати нормальний осмотичний тиск протягом усього періоду зберігання;

> мати достатню буферну ємність за кислотним та лужним показниками;

> мати оптимальну електропровідність;

> нейтралізувати шкідливу дію на спермії плазми сперми і продуктів метаболіз­му сперміїв;

> забезпечувати спермії джерелами енергії для їх виживання в аеробних та ана­еробних умовах;

> захищати спермії від холодового удару та негативного впливу мікрофлори;

> мати нейтральну або близьку до неї концентрацію водневих йонів (не нижче 6,2 і не вище 7), залежно від призначення середовища, і оптимальний осмотичний тиск;

> максимально зберігати запліднюючу здатність сперміїв.

У кінці XIX ст. І. І. Іванов вперше застосував ізотонічні розчини натрію хлориду, натрію бікарбонату та рідину Лока для розрідження сперми при осіменінні кролів, морських свинок, собак, а пізніше й корів та кобил. При цьому було відмічено над­звичайно високе пристосування сперміїв до навколишнього середовища. Вони добре зберігали рухливість у ізотонічних розчинах хлористого натрію, калію, барію, маг­нію, вуглекислого та двовуглекислого калію і навіть у розчинах дифтерійного токси­ну, антитоксину та антидифтерійної сироватки.

Проте згодом виявилося, що у чистих фізіологічних розчинах хлориду натрію та інших нейтральних солей спермії виживають гірше, ніж у їх сумішах.

У 1928 році в Японії Ямане і Като запропонували для розрідження сперми же­ребця і кроля суміш 5 %-го розчину глюкози з фосфатним буфером (рН 7,2-7,4), в якій вдалося збільшити виживання сперміїв жеребця до 116 годин. У 1929-1930 рр. В. К. Милованов зі співробітниками запропонували рецепти цього розріджувача для сперми різних видів сільськогосподарських тварин.

Однак одного розрідження, як виявилося згодом, недостатньо для збільшення ви­живання сперміїв. Як відмітив ще в свій час Л. Спалланцані, збільшити виживання сперміїв можна, застосовуючи, поряд з розрідженням, охолодження сперми. Про­те при швидкому охолодженні у сперміїв наступає температурний шок (холодовий удар). К. Н. Кржишковський, Г. Н. Павлов (1927), В. К. Милованов та І. А. Селівано- ва (1932) встановили, що захистити спермії від холодового удару можна за допомо­гою фосфоліпідів, а Філліпс і Ларді у США, враховуючи високий вміст фосфоліпідів (лецитину) у жовтку курячого яйця, включили його до складу розріджувача.

М. П. Павленко та Л. М. Павленко екстрагували з жовтка термостабільний анти- шоковий компонент, застосування якого у 3 %-й концентрації дає такий же ефект, як 30 %-й жовток.

У 1941 році Г. Солсбері, Х. Фаллер і Е. Віллет, враховуючи кращу розчинність жирових кульок жовтка у цитраті натрію, ніж у фосфаті, запропонували жовтково-ци- тратний розріджувач. Широкого розповсюдження у п'ятдесятих роках в СРСР набув глюкозо-цитратно-жовтковий розріджувач, запропонований Б. Д. Раднабазароном, до складу якого входять глюкоза, цитрат натрію та жовток курячого яйця.

Склад розріджувача повинен відповідати особливостям сперми того виду тварин, для якого він призначений. Так, у густій спермі бугая та барана швидко накопичується молочна кислота та інші продукти обміну. Для їх нейтралізації, зменшення проник­ності оболонки сперміїв, сповільнення набухання колоїдів цитоплазми розріджувач повинен містити такі буфери, як цитрат чи фосфат натрію з рН 7,8-8,0.

Заслуговують на увагу дослідження М. П. Шергіна, який у 1945 році встановив, що сперма бугая, розріджена молоком, краще виживає, ніж у 1 %-му розчині хло­ристого натрію; молоко виявилося фізіологічним середовищем для сперміїв. На цій підставі Н. Н. Михайлов запропонував молочні розріджувачі для сперми жеребця та бугая, а Г. В. Звєрєва та Б. М. Чухрій - розріджувач із сухого молока.

Слід відмітити, що некип'ячене молоко шкідливе для сперміїв, що зв'язують з альбуміновою фракцією білка, яка лише при кип'ятінні піддається змінам.

Таким чином, для розрідження сперми використовують як синтетичні, так і біоло­гічні середовища. Склад середовища залежить від того, для якого виду тварин та для якого режиму зберігання воно призначене. Для зберігання сперми при 2-5 °С широко застосовуються жовткові середовища.

Розріджувачі, що використовуються для зберігання сперми у замороженому ви­гляді, містять у своєму складі кріопротектори (гліцерин, етиленгліколь, поліетиленок- сид, рафінозу та ін.).

Для пригнічення мікрофлори до складу розріджувачів додають сануючі речовини: білий стрептоцид, пеніцилін кристалічний (натрієва або калієва сіль) та стрептомі­цин сірчанокислий або солянокислий, або суміш цих препаратів під назвою "Спер- мосан - 3".

У багатьох країнах були запропоновані сухі синтетичні препарати (семінал і нео- семінал, спермозол, лаціфос, капроген та ін.), які перед використанням розріджують у певному об'ємі дистильованої води.

Компоненти розріджувача проявляють різноманітний вплив на спермії; неелек- троліти (моно- і поліцукри) підтримують у розчинах осмотичний тиск, проявляють захисну дію під час заморожування, інактивують антитіла, зменшують електропровід­ність сперми, сприяють збереженню електричного заряду сперміїв, перешкоджають їх аглютинації; глюкоза та фруктоза можуть служити джерелом енергії; амінокислоти у розчинах створюють осмотичний тиск, виконують роль амфотерного буфера. Окремі лужні та амфотерні водорозчинні амінокислоти виконують захисну функцію, знижу­ють активність ферментів та інтенсивність обмінних процесів у сперміях; зв'язуючи кисень та перекис водню, амінокислоти можуть виконувати роль антиоксидантів.

Проте неелектроліти слабо захищають спермії від холодового удару, не забезпечу­ють буферності та електропровідності середовища.

Електроліти (цитрат натрію, тартрат, бікарбонат натрію, сульфат амонію та ін.) захищають оболонку сперміїв від набухання і знижують її проникність, позитивно впливають на обмін речовин, нейтралізують шкідливу дію токсичних продуктів об­міну, частково захищають спермії від температурного шоку; електроліти утворюють у середовищах буферну ємність, електропровідність, створюють рН розчину.

Речовини, що утворюють електролітну основу, складаються з аніонів та катіонів. Аніони проявляють сильнішу дію на зберігання сперміїв, ніж катіони. Чим вища валент­ність аніонів, тим краще виживання у їх розчинах сперміїв. Наприклад, хелатон (чоти­ривалентні аніони) проявляє найсильнішу дію на окисно-відновні процеси у сперміях. Будучи сильним комплексоном, він тимчасово зв'язує іони металів кальцію і магнію, гальмує активність протеаз, аденозинтрифосфатаз, фосфофруктокінази, гексодифосфа- тази та інших ферментів, знижує обмінні процеси у сперміях. Крім того, він володіє високими буферними властивостями і гальмує розвиток мікроорганізмів у спермі.

Жовток захищає спермії від холодового удару, при температурі нижче 16 °С під­вищує стійкість клітин проти дії токсичних речовин, гіпо- і гіпертонічних розчинів, світла та інших факторів зовнішнього середовища. Проте при швидкому охолоджені сперми, розрідженої цукрово-жовтковими середовищами, можливий шок.

Серед кріопротекторів у середовищах для заморожування сперми (гліцерин, етиленглікольполіетиленоксид, рафіноза та ін.) найвищими захисними властивостя­ми при заморожуванні володіє гліцерин. Він затримує початок кристалізації води і сповільнює ріст кристалів, знижує осмотичний тиск розчинених речовин при замо­рожуванні до евтектичної точки (-46,5 °С). Гліцерин завжди знаходиться у фазі роз­чину, внаслідок чого концентрація осмотично активних речовин зменшується, що сприяє зберіганню клітин. Проте гліцерин не індиферентна речовина по відношенню до сперміїв. Вже при концентрації 3,5 % він проявляє сильну гіпотонічну дію. При зменшенні концентрації гліцерину у середовищі зменшується його захисна дія, а при збільшенні концентрації і часу контакту при плюсовій температурі він проявляє руй­нівний вплив на структуру сперміїв.

Сануючі речовини (антибіотики, сульфаніламіди та хіміотерапевтичні препарати, спермосан - 3 та ін.) поряд з пригніченням росту мікроорганізмів дещо знижують об­мінні процеси сперміїв, тому не можна ними зловживати.

Нативна сперма володіє певними бактерицидними властивостями, у ній виявлено білок семіналплазмін, що проявляє на мікрофлору дію, адекватну пеніциліну, стреп­томіцину чи тетрацикліну. Проте, при розрідженні сперми, особливо сильному, зни­жується його захисний вплив. Застосовувані сануючі засоби не завжди дають бажа­ний ефект, до того ж вони не припиняють розмноження мікроорганізмів і негативно впливають на обмін речовин у сперміях (В. А. Яблонський, 1962).

Склад середовища залежить не лише від видових особливостей сперми, але й технології її зберігання. Наприклад, при плюсовій температурі зберігання кращі на­слідки отримують при поєднанні у середовищах електролітів та неелектролітів, при заморожуванні сперми у гранулах - перевагу віддають неелектролітам.

Зберігати сперму бугаїв при кімнатній температурі вдалося лише після розроб­ки зворотного кислотного інактивування сперміїв за допомогою слабких органічних кислот, насичення розріджувача вуглекислим газом. Проте нестійка вугільна та інші слабкі кислоти швидко розкладаються, двоокис вуглецю вивітрюється і тому згодом перейшли на нелеткі жирні кислоти: лимонну, аскорбінову, саліцилову, борну, щаве- леву, винну, яблучну, янтарну, капронову та ін. Значно ефективнішим виявився пре­парат, що пригнічує обмінні процеси у спермі - двонатрієва сіль етилендиамінтетра- оцтової кислоти (синоніми - ЕДТА, хелатон, трилон Б, селектор). Блокуючи обмінні процеси у сперміях, він збільшує їх виживання.

Розроблене М. Т. Плішком на основі хелатону глюкозо-хелато-цитратне сере­довище широко застосовується для зберігання сперми кнура при 16-20 °С.

При вірному підборі компонентів розріджувача одні з них можуть підсилювати дію інших. Наприклад, дію хелатону можуть підсилювати аргінін, глікокол та інші водорозчинні амінокислоти; дію лактози та ряду інших цукрів при плюсових темпе­ратурах зберігання підсилюють додаванням глюкози, тоді як додавання в лактозне середовище глюкози при заморожуванні сперми знижує її якість.

Слід наголосити, що ефективність розріджувачів залежить не лише від їх складу, але і від якості вихідних компонентів. Нетоксичні для сперміїв лише препарати, що випускаються спеціально для штучного осіменіння тварин (спермосан-3, лактоза в порошку, глюкозоцитрат у порошку, 2,9 %-й нейтралізований розчин цитрату натрію у ампулах), оскільки заводи, що їх випускають, перевіряють їх на нешкідливість для сперміїв. Якщо ж для штучного осіменіння використовуються не перевірені заводом препарати, то спершу слід провести таку перевірку.

Приступаючи до виготовлення середовищ для розрідження сперми, слід пам'ята­ти, що для цього можна використовувати лише хімічно чисті матеріали, які мають за­водську етикетку з обов'язковим зазначенням ступеня чистоти (ЧДА, ХЧ). Не можна використовувати відсирілі реактиви, оскільки в них неможливо враховувати кількість ввібраної води. У відсирілих цукрах, як правило, розвивається мікрофлора і накопи­чуються токсичні речовини. Медичні препарати повинні відповідати вимогам фар­макопеї і не бути шкідливими для сперміїв. Нова серія кожного препарату, особливо антибіотиків, піддається біологічному контролю, оскільки окремі з них можуть ви­явитися токсичними для сперміїв. Жовток курячого яйця має бути яскраво-оранже­вого кольору. Його отримують із свіжих курячих яєць (3-5 денного зберігання) від здорових курей. Бажано, щоб кури, від яких отримують яйця, були вигульного утри­мання і у їх раціоні містилося багато зелених кормів і вітамінів. Яйця з забрудненою шкаралупою непридатні для використання.

Перед використанням яєць їх миють щіткою, витирають марлевою серветкою і протирають спиртовим тампоном або ж опромінюють бактерицидними лампами (на шкаралупі яйця виявлено 13 видів мікроорганізмів та 7 видів пліснявих грибів).

Молоко для виготовлення молочних розріджувачів повинно бути свіжим, від здо­рових корів. Можна також використовувати сухе напівжирне молоко.

Дистильована вода має бути чистою, прозорою, без слідів металу. Для окислення летких органічних речовин до води, що піддається дистиляції, додають марганцево­кислий калій до червоного забарвлення.

Готують розріджувачі у скляній посудині і безпосередньо перед одержанням спер­ми з таким розрахунком, щоб від моменту його виготовлення і до застосування про­йшло не більше 1-2 годин.

Розріджувати сперму слід не пізніше, як через 10-15 хв. після її отримання.

Перед розрідженням сперми обов'язково визначають у ній концентрацію та рух­ливість сперміїв і на підставі цих даних визначають ступінь розрідження, тобто відно­шення об'єму середовища, котре додається на кожен мілілітр еякуляту, що має певні межі. Граничний ступінь розрідження можна визначити за формулою:

С= 1: (С х Р х рх 0,01х О КС х 1,2-1),

р ⁴ е о ³ д: ппр ⁷ '⁷

Ср - граничний ступінь розрідження;

С - концентрація сперміїв у розріджуваному еякуляті, млрд/ мл;

Р_е - рухливість сперміїв у еякуляті, бали;

Р_о - мінімально допустиме розрідження сперміїв перед осіменінням, бали;

0,01 - коефіцієнт поправки на рухливість сперміїв;

О_д - об'єм дози розрідженої сперми, мл;

КС_ппр - мінімальна кількість сперміїв з прямолінійно-поступальним рухом у дозі, млрд;

1,2 - коефіцієнт поправки на КС_ппр.

Сперму бугая, барана спочатку розріджують 1: 1 або 1: 2 у спермоприймачі, а тоді переливають її у чистий, стерильний, підігрітий до 40 °С градуйований змішувач чи мензурку і поступово доливають решту середовища. Температура розріджувача повинна відповідати температурі сперми. Якщо час між отриманням двох еякулятів складає більше 20 хвилин (а сперму отримують дуплетною садкою), то до розріджен­ня еякуляту в нього додають 5-10 % жовтка (1-2 краплі на 1 мл сперми). Середовища, що містять гліцерин, краще додавати до сперми двомоментно: спочатку 0,5: 1, а через 15-20 хв. повторно, до потрібного розрідження. Щоб переконатися, що розрідження не погіршило якості сперми, зразу після змішування її з середовищем перевіряють активність сперміїв. Якщо вона знизилась - розріджувач виготовлений не вірно. У та­ких випадках готують новий розріджувач. Розрідження сперми проводять у стериль­них умовах у камері УНБК-1 або в лабораторії, обладнаній бактерицидними лампами БУВ-30.

Ступінь розрідження встановлюють залежно від концентрації і активності спер­міїв. Допускається до розрідження сперма бугая та барана з активністю не нижче 8 балів, кнура - 7, жеребця - не нижче 5 балів, при концентрації сперміїв у бугая не менше 0,7, барана - 1,0, кнура і жеребця - 0,15 млрд на мл.

Сперму бугая можна розріджувати в 10-32 рази, сперму барана у 2-3 рази, жереб­ця і кнура - 2-5 раз. Найвищі ступені розрідження застосовують, отже, до сперми бу­гая. При потребі цей ступінь розрідження можна збільшити, довівши його до 1: 100, а то й до 1: 200. У дозі розрідженої сперми має бути 15-25 млн рухливих сперміїв.

Використовувані на станції середовища повинні періодично піддаватися біокон- тролю, особливо, коли переходять на застосування нових рецептів середовищ або ж нових серій реактивів і антибіотиків; контроль середовищ проводять за методикою визначення абсолютного і відносного показника живучості сперміїв. При цьому вста­новлюють оптимум та максимум розрідження.

Оптимум розрідження - це такий ступінь розрідження, при якому досягають най­вищої живучості сперміїв.

Максимум розрідження - найбільший ступінь розрідження, при якому живучість сперміїв не падає нижче їх живучості у нерозрідженій спермі.

Чинними інструкціями, постановами та методичними вказівками з штучного осіме- ніння рекомендовані варіанти середовищ для усіх видів сыльськогосподарських тварин для зберігання сперми при 2-5 °С, кімнатних температурах та у замороженому вигляді.

Для розрідження та короткочасного зберігання сперми бугая при 2-5 °С застосо­вують глюкозо-цитратно-жовткове середовище.

Для розрідження та заморожування сперми бугая у формі гранул користуються лактозо-жовтково-гліцериновим, а для облицьованих гранул - лактозо-фруктозо-ра- фінозо-магнієво-гліцерино-жовтковим середовищем.

Найширше розповсюдження при розрідженні сперми барана отримав глюкозо- жовтково-цитратний розріджувач. Останнім часом акцент переноситься на глюкозо- фосфатне середовище.

При зберіганні сперми кнура у жовткових розріджувачах наштовхнулися на пере­шкоди, обумовлені наявністю у плазмі сперми фосфоліпази А, що є у секреті цибу- линно-сечівниковох залоз. Цей ензим гідролізує лецитин жовтка до жирних кислот і лізолецитину, які токсичні для сперміїв і викликають коагуляцію розріджувача. Ток­сичний ефект можна частково зменшити, видаляючи плазму сперми, або хірургічно видаляючи у кнура ці залози.

Із численних середовищ для розрідження сперми кнура при температурі 16-20 °С найбільше розповсюдження отримали глюкозо-хелато-цитратні.

При фракційному методі осіменіння свиней застосовують розріджувачі-заповню- вачі (сольовий, цукровий, молочний).

Для розрідження сперми жеребця частіше всього застосовують глюкозо-жовткове, молочно-жовткове і лактозо-жовткове середовища. У тих випадках, коли осіменіння кобил проводять свіжоодержаною спермою, можна використовувати глюкозне чи цу­крове середовища.

Зберігання сперми. Штучне осіменіння сільськогосподарських тварин нині про­водиться переважно збереженою спермою. Отже, ефективність використання цього методу залежить, в першу чергу, від тривалості виживання сперміїв у спермі, що збе­рігається. Як уже підкреслювалося, воно залежить як від енергетичних запасів спер­ми, так і від інтенсивності їх використання.

Розробляючи методи зберігання сперми, вчені виходили з наявності у природі двох станів живих організмів: життєдіяльного та нежиттєдіяльного (А. М. Голдовський). У життєдіяльному стані істота може проявляти повну активність (біоз) чи дещо упо­вільнену активність (гіпобіоз); у нежиттєдіяльному стані вона може перебувати в ана­біозі (тобто не проявляючи функції життєдіяльності), або ж у мезабіозі (проявляючи лише процеси дисиміляції, тобто розпаду речовин клітини).

Звичайно метою зберігання живих об'єктів є переведення їх у нежиттєдіяльний стан, коли життєспроможні структури не ушкоджуються, енергетичні запаси не витра­чаються, а їхня функція, при певних умовах, може бути відновлена (Ф. І. Осташко).

Для збільшення виживання сперміїв поза організмом необхідно знизити у них ак­тивність обмінних процесів, загальмувати їх рухливість і розрідити секрети додатко­вих статевих залоз розчинами, що не активують рухливості сперміїв та не руйнують їх ліпопротеїдного покриву. Цього можна досягти шляхом застосування відповідних розріджувачів, зниження температури сперми, створення у ній анаеробних умов, вне­сення у розріджувачі метаболічних інгібіторів (органічні кислоти, хелатон та ін.) і зниження за рахунок цього рухливості сперміїв.

Зберігати можна лише сперму доброї якості. При виборі способу зберігання спер­ми виходять з її видових особливостей. Сперма тварин з піхвовим типом природно­го осіменіння відрізняється вищою живучістю сперміїв поза організмом самця, ніж сперма тварин з матковим типом осіменіння. При будь-якому методі зберігання необ­хідно перевести спермії у стан анабіозу. Найширше для цього застосовують холод, не допускаючи швидкого охолодження, яке може призвести до загибелі сперміїв від холодового удару.

У практиці тваринництва нині користуються короткотривалим зберіганням спер­ми при температурі 2-5 °С (бугаїв - до 72 год., баранів - до 24 год., жеребців -до 48 год.), короткотривалим зберіганням при температурі 16-20 °С (кнурів - до 72 год.) і тривалого зберігання - у парі рідкого азоту при -196 °С.

Короткочасне зберігання сперми при температурі танення льоду (2-5 °С). Цей метод досить простий, доступний, він зіграв велику роль у широкому розповсюджен­ні штучного осіменіння. Після розрідження і півгодинного витримування сперми при кімнатній температурі, її розфасовують у флакони (ампули, пробірки і т. п.) і ставлять на зберігання у холодильник при температурі 4 °С чи у термос з льодом. У першому випадку флакони зі спермою обгортають шаром вати, поміщають у поліетиленові мі­шечки і ставлять у кювету з льодом, додаючи туди трохи холодної води, і поміщають на полицю холодильника, де температура підтримується у межах 2-5 °С. Якщо ж для зберігання сперми користуються широкогорлим харчовим термосом, то його попе­редньо заповнюють наполовину об'єму дрібними кусками чистого промитого у воді льоду з температурою 0 °С. Якщо температура льоду нижче нуля (не видно танення), то після промивання водою дають йому постояти у теплому приміщенні, поки не по­чне танути.

Зверху льоду кладуть кружок поліетиленової плівки, тоді шар сірої вати, товщи­ною 0,5 см, а тоді ставлять зверху вертикально чи похило флакони зі спермою. Через 3-4 години шар вати видаляють і ставлять флакони безпосередньо на лід. У такій спермі дихання та фруктоліз сперміїв гальмується у 2-25 разів (М. П. Шергін). Проте сперма окремих бугаїв погано переносить охолодження.

Зберігання сперми при кімнатній температурі. Ще у 1924 р. К. Н. Кржижковсь- кий та Г. Н. Павлов встановили, що виділювана під час дихання сперміїв СО₂, всту­паючи в реакцію з водою, утворює вугільну кислоту, яка легко проникає крізь обо­лонку сперміїв і гальмує у них обмін речовин. На цій підставі Ван Демарк і Шарма у 1957 р. запропонували розріджувач ІВТ (іллінойський для варіюючих температур). У розрідженій ним спермі після насичення її вуглекислим газом до рН 6,2-6,4 спермії зберігали свою живучість при кімнатній температурі до 5-7 днів. В. К. Милованов та М. В. Ситіна запропонували бікарбонатно-фосфатний розріджувач, у якому СО₂ утворювалася безпосередньо у розрідженій спермі внаслідок взаємодії між гідрокар­бонатом натрію і однозаміщеним фосфатом калію:

№НС0₃ + кн₂ро₄ = ШКИР0₄ + н₂со₃

Дослідники Корнельського університету (Фут, Янг, Данн) запропонували в 1958 р. своє середовище, головним інгібітором рухливості сперміїв у якому була лимонна кис­лота, а Кок в Нідерландах використав з цією метою хелатон (трилон Б, ЕДТА - етилен- діамінтетраоцтова кислота). Це започаткувало серію середовищ для зберігання сперми при кімнатній температурі, до складу яких входять органічні кислоти (аскорбінова, са­ліцилова, винна, янтарна, яблучна та ін.) чи хелатон. Розріджену таким середовищем сперму розфасовують у щільно закупорювані флакони чи запаювані ампули і зберіга­ють у коробці з добрим теплоізолюючим матеріалом чи термосі з льодом, що тане.

Сперму кнура, розріджену хелатоновим середовищем (за М. Т. Плішко), зберіга­ють у термосі, заповненому на 1/4 льодом, поверх якого кладуть поліетиленову плів­ку, а на неї - шар вати товщиною 1-1,5 см.

Колби чи флакони з розрідженою спермою закривають (не герметично) плівкою або пергаментним папером і ставлять поверх вати у термосі. Сперму жеребця збері­гають у термосі в простерилізованих скляних банках місткістю 100 мл з притертими корками або в спеціальних скляних ампулах місткістю 30 мл, що закриваються гумо­вими корками; їх поміщають у двошарові ватно-марлеві мішечки і повільно охоло­джують у термосі.

Наявний у складі розріджувача хелатон при кімнатній температурі інактивує фер­менти і пригнічує обмін речовин у сперміїв. При підігріванні сперми до температури тіла (у геніталіях осімененої самки) поновлюється рухливість сперміїв.

Тривале зберігання сперми при низьких температурах є найбільшим досягненням у галузі штучного осіменіння другої половини ХХ сторіччя. Короткочасне зберігання сперми при 2-5 °С та при кімнатній температурі має істотні недоліки: короткотрива- лість, великі транспортні витрати (необхідно щодня чи через день доставляти сперму на пункти), неповне використання сперми на пунктах, велике навантаження і нерівно­мірне використання плідників. Ці недоліки відпадають при зберіганні сперми у гли­боко замороженому стані. Воно дозволяє рівномірно використовувати протягом року плідників, повністю використовувати сперму на пунктах і створювати її запаси (банки сперми) на племпідприємствах; створюються необмежені можливості для племінної роботи, оскільки сперма тепер може транспортуватися на безмежні віддалі, включа­ючи й міжнародну торгівлю; її можна зберігати десятки років; спрощується й оцінка плідників за якістю нащадків.

Проблема біологічної дії холоду на спермії бере свій початок з досліджень Спалан- цані (1787), Монтегаца (1866), І. І. Іванова (1907), К. Н. Кржижковського та Г. Н. Пав­лова (1922). Було встановлено, що тривале зберігання гамет можливе лише в умовах повного анабіозу, при якому гальмуються всі біохімічні процеси.

Сперма - це біологічна рідина, у якій зважені клітини (спермії). При повільному її заморожуванні наступає кристалізація води. Її можна уникнути при надшвидкому заморожуванні (вітрифікація) з швидкістю 5 тис. градусів за секунду.

При вивченні явища анабіозу у рослинних та тваринних клітин П. Г. Бахметьєв (1902) прийшов до висновку, що однією з причин їх загибелі є втрата води їх прото­плазмою при охолодженні. Академік Максимов (1913) довів, що додавання до замо­рожуваних рослинних клітин гліцерину захищає їх від обезводжування протоплазми, денатурації білка, кристалізації льоду. Згодом це підтвердили на сперміях А. Д. Бер- нштейн та В. В. Петропавловський (1936), які вивчали зміни живучості сперміїв при їх охолодженні до -15...-23 °С. Проте цей факт не був критично оцінений і викорис­таний. Дещо пізніше Янель (1938) встановив, що спермії чоловіка володіють надто високою стійкістю до охолодження у рідкому азоті (мінус 196 °С) і навіть у рідкому гелії (мінус 269 °С).

У 1948 р. І. В. Смирнов вперше заморозив нерозріджену сперму жеребця, кроля, бугая та барана у пакетиках з алюмінієвої фольги на поверхні твердого двоокису вуг­лецю (мінус 79 °С) та у парі рідкого кисню, але більша частина сперміїв при цьому гинула. Внаслідок багаторазового осіменіння овець та корів такою спермою автор отримав у 1950-1951 рр. ягнят та телят. Цю роботу було визнано відкриттям.

У 1948 році група англійських біологів з Кембріджського університету на чолі з С. Полджем, опрацьовуючи технологію заморожування сперми півня, випадко­во виявили захисні властивості гліцерину і запропонували у 1952 році технологію заморожування сперми бугая з його використанням. Технологія виявилася склад­ною - спочатку сперму розріджували, охолоджували 4 години до 5 °С, повторно роз­ріджували охолодженим середовищем з вмістом 20 % гліцерину, знову витримували 12-18 годин при 5 °С, розфасовували у скляні ампули і заморожували у ступінчас­тому режимі.

У 1964 р. японські дослідники Х. Нагазе і Т. Ніва запропонували заморожувати сперму у вигляді гранул на блоках твердої вугільної кислоти. Методика виявилася пер­спективною і у багатьох країнах, в тому числі й в Україні, з'явилися її удосконалення.

Сперма є специфічною біологічною рідиною. У процесі заморожування вона по­винна пройти крізь зону субнормальних температур (20...0 °С), у якій можливий температурний шок; зону низьких температур (від 0° до мінус 50°), - тут можлива кристалізація внутрішньоклітинної води та осмотичні зрушення; зону дуже низьких температур (від -50 до -196°), тобто тверду фазу, у якій хімічні реакції сповільнюють­ся чи зупиняються, процеси старіння та переродження припиняються.

У процесі розморожування спермії також проходять ці зони, лише у зворотному напрямку. При цьому у температурній зоні -196.-51 °С можлива рекристалізація, а від -50 до 0 °С можливі осмотичні зрушення. Тому необхідними передумовами успішного заморожування сперми є захист сперміїв від холодового удару під час охо­лодження до 0 °С та захист сперміїв від кристалізації внутрішньоклітинної вологи під час заморожування. Цього можна досягти при суворому дотриманні технології розрідження, охолодження та заморожування і забезпеченні стабільної температури у процесі зберігання. Припинення процесів старіння та переродження у замороженій спермі дозволяє зберігати її безмежно довго. Після розморожування життєвість спер­міїв, їх рухливість та запліднююча здатність поновлюються і введені у статеві шляхи самки вони виконують свою біологічну місію.

Для захисту сперміїв від кристалізації води до складу розріджувача вводять кріопро- тектори (гліцерин, лактозу, сахарозу чи рафінозу). Головним серед них є гліцерин. Це ендоцелюлярний малотоксичний для сперміїв кріопротектор, який захищає їх від зне­воднення протоплазми, кристалізації льоду, денатурації білка. Проте введення гліцерину у середовище знижує його осмотичний тиск, а статеві клітини надзвичайно чутливі до виникнення концентраційних градієнтів при переміщенні розчинених у їх протоплазмі речовин у навколишнє середовище і навпаки. Тому для компенсації тиску вводять у се­редовище також екзоцелюлярні кріопротектори (лактозу, сахарозу чи рафінозу).

Серед холодових агентів, що випробовувалися при заморожуванні сперми, слід згадати сухий лід чи сніг (-78,9 °С), рідке повітря (-193,5.-183 °С, залежно від спів­відношення азоту та кисню) його компоненти - рідкий азот (-195,8 °С), рідкий кисень (-182,8 °С), рідкий водень (-252,8 °С) та рідкий гелій (-268,9.-272 °С) найпридатні- шим виявився рідкий азот. Він не отруйний, хімічно інертний, не утворює вибухових сумішей, не горить і не підтримує горіння, хоча, безумовно, при роботі з ним потрібно дотримуватись певних передосторог.

Нині сперму бугаїв заморожують у формі не облицьованих чи облицьованих гранул, у поліпропіленових соломинках, полістиролових піпетках, для цього опрацьовані від­повідні рецепти середовищ та технологія заморожування. Вагомий внесок у цю справу зробив Ф. І. Осташко з очолюваною ним школою дослідників. При одномоментному розрідженні сперми за технологією Ф. І. Осташка через 5-10 хв. після її отримання в неї вносять підігрітий до 30-35 °С розріджувач, що містить всі необхідні компонен­ти, в тому числі кріопротектор. При двомоментному розрідженні перше середовище
вносять у сперму зра­зу після її отримання, а тоді через 5-10 хв. проводять додатко­ве розрідження сере­довищем № 2.

Розливають роз­ріджену сперму у флакони, закривають їх стерильними гу­мовими корками і ви­тримують 4-6 годин у холодильнику при 2-5 °С (еквілібрація). Тоді приступають до заморожування спер­ми за тією чи іншою технологією.

При заморожу­ванні сперми бугая у вигляді гранул на фторопластовій плас­тинці у парі рідко­го азоту занурюють пластинку на 1 хв. у рідкий азот (до при­пинення кипіння азоту), тоді закріплюють її на висоті 2-3 см над поверхнею азоту і за допомогою пластмасового шприца з голкою чи спеціальної крапельниці накрапу­ють сперму у ямки (заглиблення) пластинки по 0,1-0,2 мл (при виготовленні малих концентрованих гранул) чи 0,5-1,0 мл (для великих гранул). Витримують пластинку зі спермою 2-3 хв. над рідким азотом, тоді занурюють її на 1-2 хв. у азот, виймають і згортають гранули охолодженою лопаткою у марлеві мішечки чи контейнери і пере­носять у посудину Дьюара на зберігання. Проте необлицьовані гранули незахищені від мікробного забруднення.

Для одержання облицьованих гранул заповнюють розрідженою спермою поліети­ленову трубку діаметром 3,8-4 мм, товщиною стінки 120 мкм, розділяють її за допо­могою автоматичного приладу на окремі дози по 0,25-0,33 мл і загерметизовують їх, охолоджують і заморожують. Потужність запропонованої Ф. І. Осташком технологіч­ної лінії - 2 000 спермодоз за 1 годину (рис. 31).

Рис. 31. Схема технології асептичного взяття, консервування та використання сперми бугаїв (за Ф. І. Осташком): 1 - механічне чучело, 2 - зібрана штучна вагіна, 3 - відділена частина спермоприй- мача з еякулятом, 4 - визначення маси еякуляту, 5 - відділена чохол-пробірка з про­бою сперми, 6 - штатив для фіксації спермоприймача, 7 - відбір проби для мікро­скопування, 9 - пристрій для внесення розріджувача у спермоприймач-змішувач, 10 - перефасування розрідженої сперми в трубку, 11 - автомат ІУЖ для виготовлен­ня облицьованих гранул, 12 - туба, 13 - пристрій для еквілібрації і заморожування сперми, 14 - заморожування сперми, 15 і 16 - інструменти для осіменіння корів і телиць.

У 1975 р. Касу (Франція) вперше застосував для фасування сперми бугаїв поліпро­піленові соломинки (пайети) місткістю 0,5 мл. За цією технологією отриману сперму
розріджують середовищем "Леціфос-271" з додаванням 10 % курячого жовтка або се­редовищем "Леціфос Пас-470", розфасовують її під вакуумом у соломинки, кінці яких герметизують полівініловим спиртом або запаюють зварювальним апаратом, марку­ють, витримують 2 години у воді температурою 5 °С і заморожують у парі азоту.

Згодом з'явилася технологія заморожування сперми у мініпайетах об'ємом 0,25 мл, яка дозволила заготовляти від бугая 30-40 тис. спермодоз за рік.

Довший час не вдавалося заморозити сперму кнура, що відзначається великим об'ємом еякуляту, високою чутливістю сперміїв до низьких температур та особливос­тями обміну речовин.

У 1972 р. німецькі дослідники Ріхтер та Лідіке повідомили про успішне замо­рожування сперми кнура. Це надихнуло учених до подальших пошуків і незабаром з'явилася белтсвільська технологія (США), яка, на жаль, виявилася громіздкою, дуже неекономною (з одного еякуляту вдавалося отримати лише одну спермодозу) і тому вона не знайшла практичного застосування.

В даний час у світі користуються чотирма методами заморожування сперми кну­ра: американським (Рп^еі і /отоп), німецьким (Westendorf з співр.,1975), французь­ким - ШИЛ (Paquignon і Courot, 1976) та шведським (Larsson з співр.,1977). Ці мето­дики передбачають еквілібрацію цілого еякуляту чи позбавлених плазми сперміїв при 15 °С; згущення сперми шляхом центрифугування і додавання невеликої кількості розріджувача без гліцерину; додавання решти розріджувача і розрі