Нові напрямки біотехнології відтворення

Великим резервом підвищення ефективності відтворення тварин є більш повне використання наявних у яєчниках овоцитів через запліднення їх поза організмом. В 1981 р. у США та в Радянському Союзі (Л. К. Ернст зі співробітниками) вдалося успіш­но запліднити недозрілі овоцити великої рогатої худоби і отримати перших телят.

Метод багатообіцяючий і якщо в медицині його використовують сьогодні резуль­тативно, то цього не можна сказати про тваринництво.

Ооцити для запліднення поза організмом можна брати від телиць, корів, та навіть телят. Miyamura з співр. (1996), досліджуючи яєчники двох корів чорної японської породи виявили у першої корови 86 182 фолікули, з них 82 572 (95,8 %) були первин­ними, 2 530 (2,9 %) - примордіальними, 837 (1,0 %) - вторинними і 243 (0,3 %) - по­рожнинними. У другої корови виявлено 68 156 фолікулів, співвідношення яких було, відповідно, 62 990 (92,4 %), 4 058 (6,0 %), 833 (1,2 %) і 275 (0,4 %).

У яєчниках пренатальних плодів виявляли від 75 000 до 300 000 ооцитів, кількість яких з віком зменшується.

В яєчниках 5-денних телят уже виявляли фолікули діаметром 5 мм. У 7-місячних телят виявляли біля 50 фолікулів (Evans з співр., 1994). Автори вважають, що вико­ристання ооцитів плодів та статево недозрілих телят для запліднення in vitro є засо­бом значного генетичного прискорення процесу відтворення.

Запропоновано методику ICI (intra cell insemination) - ін'єкцію одного відібраного спермія в цитоплазму яйцеклітини або під прозору оболонку, що полегшує процес "злиття" гамет. Ця методика знайшла практичне застосування у гуманній медицині у випадку низької концентрації сперміїв у донора чи з розладами їх рухливості (Iritani з співр., 1995).

До методик полегшення контакту спермія з яйцеклітиною належать:

1. Часткове розрихлення прозорої оболонки за допомогою ензимів трипсину чи пронази, або ж видалення оболонки.

2. Порушення цілості прозорої оболонки за допомогою мікроголки чи лазера, або ж розрихлення її цівкою розчину низької кислотності (ФБС чи розчин Тіроде з рН 2,5).

3. Ін'єкції капацитованого спермія чи декількох сперміїв під прозору оболонку.

4. Ін'єкції спермія до цитоплазми ооциту (intracytoplasmic sperm injection, ICSI). Для цього можуть бути використані будь-які спермії, в тому числі нерухомі, мертві, морфологічно змінені, окремі голівки сперміїв.

Заслуговує уваги ідея стимулювання дозрівання фолікулів у статевонедозрілих тварин, що дозволить скоротити інтервал між поколіннями і прискорити ранню оцін­ку тварин за нащадками.

Успіх запліднення залежить від ступеня зрілості як овоцитів, так і сперміїв. Тому цілком природними є пошуки середовищ для культивування та капацитацїї сперміїв.

Проводяться досліди по заплідненню овоцитів великої рогатої худоби спермія­ми бугая в яйцепроводах інших видів тварин. Науково-технічний прогрес в області трансплантації ембріонів дозволяє в недалекому майбутньому перейти на визначення статі у пересаджуваних ембріонів. Запропоновано це робити за допомогою хромо­сомного аналізу вирізаного кусочка трофобласта, імунологічної ідентифікації на по­верхні ранніх ембріонів специфічних антигенів, визначення статевого хроматину у інтермітотичних ядрах клітин та ін., на жаль ці методики ще не доведені до практич­ного застосування у виробничих умовах.

Великі перспективи обіцяє розділення ембріонів на бластомери, які на початкових стадіях дроблення є тотипотентними, тобто кожен з них може розвинутися в окремий зародок.

Таким чином, з одного ембріона можна копіювати (клонувати) ідентичних (моно- зиготних) близнят і значно підвищити ефективність використання донорів. З цією ме­тою користуються методами мікрохірургічного, ферментативного чи хімічного розді­лення ембріонів на половинки, четвертинки і т. д.

Практиків тваринництва давно цікавить можливість раннього визначення статі за­родків та її регуляції.

Серед наявної інформації найбільше уваги приділяли саме таким напрямкам до­сліджень.

Найперспективнішим є метод розділення сперміїв на носіїв хромосоми Y та X, яке дозволяє визначати стать вже під час запліднення. Проте чисельні дослідження не дали бажаних наслідків. Окремі методики з цієї серії робіт базувалися на визначенні вмісту ДНК, вміст якої в одному спермії бугая, барана та кнура становить 3,36; 2,93 та 2,60 пг. Хромосома Х є більшою і отже містить більше ДНК, ніж хромосома Y, але різниця вмісту ДНК у сперміях Х і Y у бугая становить 3,9 %, кнура - 3,7 % і бара­на - 4,2 % (Johnson і Clarke, 1988), тобто, надто малі для визначення статі.

Дещо ефективнішою виявилася методика розділення Х та Y-сперміїв шляхом цен­трифугування чи вільно-проточного електрофорезу, використання антитіл проти від­повідного типу сперміїв, цитогенетичного аналізу плодових вод, але і вони не готові до практичного використання.

Найперспективнішими на даний час є гормональні дослідження плодових вод, крові плода, а то і крові матері після імплантації зародка. Найкращі результати дає визначення тестостерону, вміст якого в алантоїсній рідині на 100-й день вагітності вище 320 пг/мл є показником чоловічої статі плода, а нижче 240 пг/мл - жіночої статі (Basrur і Bongso, 1980).

Перспективним є застосування полімеразно-ланцюгової реакції, що передбачає біопсію 5-10 бластомерів 6,5-7-денного зародка і екстрагування з них ДНК. Прижив­лення таких зародків у дослідах Ellis з співр. (1988) становило 44 %.

Заслуговує на увагу ультрасонографічний метод, який базується на виявленні ста­тевого виростка у плода, що є зачатком прутня у самців чи клітора у самиць, і може бути виявленим на 55-й день вагітності (Curran з співр.,1992).

В Австралії опрацьована комплексна технологія трансплантації ембріонів, що включає швидке (менш, ніж за три години) визначення статі ембріона за допомогою полімеразної ланцюгової реакції-виявлення Y-хромосоми ДНК, характерної лише для чоловічої статі. Запропоновано портативну тест-систему для визначення статі ембрі­она безпосередньо на фермі.

Важливими слід визнати також дослідження з отримання химерних тварин - орга­нізмів, що складаються з генетично різнорідних тварин чи клітин. Практично химери можна отримувати шляхом з'єднання двох ембріонів чи двох половинок ембріонів від різних (зразу чотирьох) батьків.

Проте методика отримання химер дуже складна. Наприклад, при мікрохірургіч­ному отриманні химер розтинають спеціальним мікроножем прозору оболонку, видо­бувають тонким гачком ембріон, розрізають його на половинки і кожен такий новий "половинчастий" зародок пересаджують у порожні прозорі оболонки незапліднених яйцеклітин, дегенерованих зародків чи ооцитів і з них формуються бластоцисти в такому ж темпі, як і з неоперованих зародків. Нормальний розвиток зародків порушу­ється лише після поділу їх на 4 і більше частин.

Застосовують також ін'єкції окремих бластомерів у внутрішньоклітинну масу ін­шого ембріона. Широко застосовуються також хімічні, фізичні, імунобіологічні мето­ди (для розчинення прозорої оболонки роз'єднання бластомерів, їх злиття і т. п.).

Розділені навпіл ембріони впродовж 30-хвилинної інкубації відновлюють свої морфологічні особливості (Albihn з співр. 1990).

Химеричні зародки можуть знайти застосування при отриманні міжвидових ва­гітностей або при ін'єкуванні у бластоцисту відповідних генів із стовбурових клітин.

Такі химеричні зародки лабораторних тварин інкубують певний час у відповід­ному середовищі, а зародки домашніх тварин - у перев'язаному яйцепроводі вівці. Характерною рисою химер є унікальність кожної з них.

Прогрес у тваринництві значною мірою визначається ефективністю успадкування господарсько-корисних ознак тварин їх нащадками. Наявні на сьогодні методи дозво­ляють переносити генетичну інформацію з геному одного організму в інший, зміню­вати функцію того чи іншого власного гена за рахунок вставок в нього чи біля нього чужого гена і отримувати на цій основі трансгенних тварин. Методами молекулярної генної інженерії можна виділяти з ДНК ген, що визначає бажану ознаку у одного ор­ганізму, і переносити його в інший.

Можливості генної інженерії значно розширилися після відкриття в 70-х роках мікробних ферментів-рестриктаз, які дозволяють розрізати молекули ДНК в чітко ви­значеному місці, виділювати необхідні ділянки молекули і штучно з'єднувати гени. Це дозволяє шляхом мікроін'єкцій в зиготи вносити бажану ДНК в геном тварини.

У 1985 р. Хаммер та ін. отримали трансгенних свиней і овець. Але результатив­ність подібних дослідів поки що дуже низька. Так, для одержання одного трансген­ного ягняти потрібно було отримати раніше 1 032 ін'єктовані зиготи, а для одержання 2-х трансгенних поросят - 2 035 ін'єктованих зигот.

Увагу дослідників останнім часом привертає тема клонування організмів. Доно­рами клонів можуть бути ембріони. При звичайних способах розділення ембріонів можна отримати 2-4 ідентичних теляти, а застосовуючи методику виділення блас­томерів з ембріонів кожен бластомер може дати початок одному з монозиготних різ- номанітностей. Це може стати методом швидкого розмноження генетично цінного матеріалу. Вважають, що всі бластомери з 8-18-клітинного ембріона і більшість з 32- клітинних придатні для клонування. Якщо прийняти 20 %-ну ефективність методу, то з 32-клітинного зародка можна отримати 6 ідентичних клонів, при використанні яких в якості донорів можна отримати 36 ідентичних зародків.

Одним з варіантів мікроін'єкції може бути введення очищеного специфічного фрагменту ДНК (гену) у пронуклеус одноклітинного зародка. Такі мікрооперації про­водилися у Польщі (Jura з співр.,1994). Експериментатори вводили фрагменти ДНК гормону росту в ядра недозрілих ооцитів та зигот великої рогатої худоби. Найвищий процент ембріонів отримано на стадії бластоцисти (48-63 %) при ін'єкціях двоклі- тинних зародків та інкубації їх у присутності моношару в середовищі Менезо В2.

Використовуючи в експериментах отримані in vitro зародки, вдалося отримати трансгенних тварин, що продукували з молоком лактоферин людини (Krimpenfort з співр., 1991). Проведено також досліди по використанню отриманих in vitro зародків для прищеплення їм гену рецептора естрадіолу та стимулятора утворення інсуліну. З цієї точки зору високопродуктивні молочні корови можуть бути продуцентами вели­ких кількостей гетерологічних білків, в тому числі з терапевтичною дією. Великі пер­спективи тут покладають на використання первинних зародкових стовбурових клітин в якості вектора для введення у зародки ДНК (замість мікрохірургічних ін'єкцій під прозору оболонку).

Встановлено, що застосування методики мікроін'єкцій ДНК для отримання одно­го трансгенного теляти необхідно здійснити біля 1 000 ін'єкцій (Eystone, 1994).

Проведено серію експериментів з введення екзогенної ДНК у спермії методом "електросверління" їх чи інкубації у розчині ДНК перед осіменінням корів. Від 300 осіменених корів отримано 45 телят та 41 плід, з них лише в одного теляти підтвер­джено успіх експерименту ^^е11аЫег з співр., 1995).

Таким чином, для інтенсифікації тваринництва, більш повної реалізації створено­го генетичного потенціалу продуктивності тварин, поряд з традиційними необхідно оволодівати новими методами трансплантації ембріонів, моделювання селекційних ознак, генної інженерії, біотехнологічного керування процесом відтворення.

Питання для самоконтролю

1. Дайте визначення поняття «трансплантація ембріонів».

2. Які вимоги пред'являють до тварин при відборі їх на донорів та реципієнтів емб­ріонів.

3. Які знаєте методи викликання суперовуляції у донорів, чим вони відрізняються?

4. Як добиваються синхронізації охоти у донорів і реципієнтів? Для чого це ро­блять?

5. Якими методами користуються для вимивання ембріонів?

6. У чому полягає методика нехірургічного вимивання ембріонів?

7. Охарактеризуйте ранні стадії розвитку ембріона.

8. Як проводять оцінку вимитих ембріонів?

9. Охарактеризуйте методику короткочасного зберігання ембріонів.

10. Дайте характеристику нехірургічного пересаджування ембріонів.

ФІЗІОЛОГІЯ ВАГІТНОСТІ

Вагітність - graviditas - складний фізіологічний стан організму самиці під час плодоношення. Він розпочинається від запліднення і закінчується родами. За часом виникнення вагітність буває первинною і повторною, а за кількістю плодів - одно- плідною і багатоплідною. У великих тварин вагітність звичайно буває одноплідною, у дрібних - багатоплідною. Двійнята у корів народжуються в 1-5 % випадків, у ко­бил - в 4-5 %, хоча трапляються випадки і багатоплідності у одноплідних тварин. Так, в літературі описано випадок, коли в матці однієї корови, що народила одне теля, виявили ще 15 недорозвинених плодів.

Багатоплідна вагітність у одноплідних тварин буває наслідком множинної овуляції (поліовуляції). Типовим прикладом багатоплідності тварини є свиноматка, яка звичай­но народжує 10-12 поросят за опорос, сука (7-10 цуценят) та кішка (2-5 котенят).

За перебігом вагітність буває фізіологічною та патологічною.

Виходячи з внутрішньоутробних особливостей закладання та розвитку орга­нів та тканин зародка, протягом вагітності окремі автори виділяють у ній такі стадії: Г. А. Шмідт - зародкову, передплодову та плодову; А. П. Студєнцов ембріональну, пло­дову (фетальну) та післяплодову (постфетальну). Ми виділяємо в ній ранню ембріо­нальну (стадія яйця), - від запліднення до розриву прозорої оболонки; ембріо-плацен- тарну - від денудації ембріона, закладки його тканин і органів до формування плодо­вих оболонок (плацентації); і третю стадію - плодову чи фетальну, коли відбувається розвиток органів, плацентарного кровообігу та набуття плодом рис, характерних для даного виду тварин. Завершується ця стадія родами.

8.

Зигота, що утворилася при заплідненні внаслідок злиття ядер яйця та спермія, дає початок новому організму, перетворюється на зародок, який піддається швидкому дробленню, спочатку на два бластомери, тоді на чотири, вісім і т. д., зберігаючи при цьому цілісність прозорої оболонки. Формується згусток бластомерів, що нагадують собою шовковицю, це дало йому назву морула (рис. 48). Вже на стадії 8-ми бласто­мерів у поділі морули проявляється деяка нерівномірність та асинхронність - різні за розмірами бластомери дробляться неодночасно. Так, на стадії 14-ти бластомерів 4 з них виявляються більшими, а 10 - меншими. Згодом на одному з полюсів зародка під
прозорою оболонкою згруповуються в один ряд сплюснуті бластомери, що утворю­ють зародковий вузлик ембріобласт (рис. 48, ГУ-г).

Потім дрібні бластомери, що поділяються швидше, обростають з усіх боків великі і утворюють навколо них периферійний шар клітин - трофобласт - живильний листок (рис. 48, ГУ-а). Він є тим клітинним матеріалом, з якого розів'ється згодом судинна оболонка - хоріон (див. нижче). Матеріалом же для розвитку зародка служить тільки центральна група клітин, оточена звідусіль трофобластом.

Далі в центрі морули з'являються дрібні щілини, що об'єднуються разом у загаль­ну порожнину жовткового міхура, наповнену рідиною - бластоцель (рис. 48, ГУ-е). У корів це буває на 90-100-й годині після запліднення, свиней - на 111-й годині.

Жовтковий міхурець функціонує у корови, вівці, свині до 20-ти днів, у кобили - до 60-ти діб.

На 9-11-ту добу у корів, 7-8-му у овець і 6-ту у свиней прозора оболонка розри­вається, ембріон витягується, на ньому з'являється заглиблення (губа), а в середині зародка формується первинна кишка (рис. 48, УІ-14).

Надалі трофобласт швидко розростається, а центральна група клітин поділяється на дві, з яких одна називається ентобластом, а друга - ектобластом (рис. 48, У-2, 3, 4).

Після розриву прозорої оболонки трофобласт посилено розвивається і утворює свій потужний шар. Його клітинам властива висока протеолітична активність, що забезпечує необхідні умови для імплантації. Цьому також сприяють зміни, що від­буваються в ендометрії під впливом статевих гормонів. Естрогени, наприклад, ви­кликають розростання слизової оболонки та маткових залоз, а прогестерон підвищує їх секреторну активність. Внаслідок цього ендометрій набухає і у його міжклітинній рідині нагромаджуються поживні речовини, як продукт гістолізу слизової оболонки, що утворюють так зване маткове молочко або ембріотроф.

Найсильніше протеолітичні властивості трофобласта виражені у приматів, тому в місцях контакту його зі слизовою оболонкою матки її епітелій розрихлюється і емб­ріон виявляється у певному заглибленні, а навколишній епітелій, що розмножується у відповідь на подразнення, вкриває його зверху суцільним шаром. Відбувається ні- дація (заглиблення зародка в ендометрій). У м'ясоїдних і особливо у корів, свиней та кобил протеолітичні властивості трофобласта слабші і тому у місцях контактів його з ендометрієм відбувається лише часткове відшарування епітелію, потовщення та гі­перемія слизової оболонки і секреція маткових залоз - тобто, настає імплантація або прививання зародка.

Імплантація ембріона відбувається у свиней на 13-й день, овець, корів - на 17-32-й, кобил - на 40-й день після запліднення.

Далі наступає формування зачатків органів та тканин: від жовткового мішка від­окремлюється тіло зародка, після чого розпочинається період органогенезу та гісто­генезу, коли з ембріональних зачатків формуються органи і розпочинається диферен­ціація тканин, властива кожному виду тварин.

Розростаючись, клітини трофобласта утворюють два шари навколо тіла зародка. Внутрішній шар цього клітинного утворення формує своєрідну чашу, що отримала

ІІ

а

в

IV

ІІІ

V

VI і,

14 11

14 11

VII

 

VIII

Рис. 48. Схема розвитку зародка та плодових оболонок у ссавців: І - стадія двох і чотирьох бластомерів: а - прозора оболонка яйця, б - бластомери; II - стадія бластули: а - прозора оболонка; III - утворення жовткового міхурця: в - трофобласт, г - ембріобласт; IV - стадія гаструли: а - трофобласт, г - ембріобласт, д - стінка жовткового міхура, е - порожнина жовткового міхура; V - стадія формування трьох за­родкових шарів: 1 - прохоріон, 2 - ектодерма, 3 - мезодерма, 4 - ентодерма; VI - стадія започаткування амніону: 1 - прохоріон, 4 - ентодерма, 5 - зародок, 6 - передня складка амніону, 7 - стінка жовткового міхура, 14 - первинна кишка; VII - утворення амніону: 8 - ембріон, 9 - трофобласт, 10 - жовтковий міхур, 11 - пупкове кільце, 12 - порож­нина амніону, 13 - амніон, 14 - первинна кишка; VIII - початок розвитку алантоїсу: 8 - ембріон, 9 - трофобласт, 10 - жовтковий міхур, 11 - пупковий канатик, 12 - порожнина амніону, 13 - амніон, 14 - кишкова порожнина, 15 - пупок амніону, 16 - прохоріон, 17 - алантоїс; ІХ - стадія дальшого росту алантоїсу та ворсинок: 12 - порожнина амніону, 17 - алантоїс; Х - стадія зростання зовнішньої стінки алантоїсу з серозною оболонкою та формування прохоріону: 12 - порожнина амніону, 17 - алантоїс.

IX

назву амніон чи водна оболонка. В ділянці пупкового кільця амніотична оболонка переходить на шкіру (рис. 48, VII-13).

В амніотичній порожнині накопичується рідина, в якій зародок вільно плаває.

З заднього кінця зародкової трубки випинається порожнистий сліпий паросток, що проходить уздовж пупкової протоки, випинає за собою клітини мезобласта і, посту­пово збільшуючись, утворює розширену порожнину - первинний сечовий мішок, або алантоїс (рис. 48, VIII-17). Він швидко розростається разом з своїми кровоносними судинами і є вмістилищем первинної сечі плода, яка надходить сечовою протокою, що називається урахус.

На поверхні трофобласта утворюються ворсинки і він називається тепер прохо- ріон (рис. 48, VIII-16). У кожній такій ворсинці виділяють епітеліальний шар і спо­лучнотканинну основу. З часу проростання у ворсини кровоносних судин прохоріон перетворюється на хоріон (судинну оболонку). Процес заглиблення трофобласта в слизову оболонку матки, розвиток хоріональної оболонки, який спричиняється до встановлення зв'язку між материнською тканиною і ростучим плодом, називається плацентацією.

Дуже різкі зміни відбуваються у слизовій оболонці матки (див. далі), яка разом з хоріоном утворює плаценту. Плацента поділяється на дві частини: материнську і пло­дову. Материнська частина складається зі зміненої слизової оболонки матки, плодова частина - з судинної оболонки плода з її ворсинками.

Таким чином, плід виявляється оточеним трьома оболонками: 1) водною, 2) сечо­вою і 3) судинною. (рис. 48, Х-12, 17). Він зв'язаний з своїми оболонками пуповиною, що складається з кровоносних судин і сечової протоки (урахуса).