Производные 1,4-бензодиазепина

Общие свойства веществ.

Распределение производных 1,4-бенздиазепина по органам происходит в три стадии:

· 1-ая характеризуется падением концентрации в крови и накоплением в паренхиматозных органах;

· на 2-ой стадии идет накопление соединений во всех органах. Предел накопления соединений в тканях определяется кажущимся объемом распределения (Vр);

· 3-я стадия, самая продолжительная по времени – характеризуется накоплением соединений в органах выделения (печени, почках), с одновременным уменьшением в остальных тканях органов.

Наибольшее содержание 1,4-бенздиазепинов в ЖКТ, тканях печени, почек.

Ультрафиолетовые спектры

В электронных спектрах производных 1,4-бенздиазепина имеется 3 полосы поглощения с λ_max в областях:

1. 200-215 нм

2. 220-240 нм

3. 290-330 нм

Две первые полосы соответствуют возбуждению ароматических хромофоров. Третью длинноволновую полосу относят к азометиновой связи, сопряженной с бензогруппой.

По характеру поглощения в УФ-области 1,4-бенздиазепины относятся к соединениям, абсорбция которых изменяется от величины значений рН:

- в кислой среде – за счет протонирования атома азота 1 (у хлордиазепоксида) и 4 (1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина – нитразепам, оксазепам, диазепам);

- в щелочной среде в молекуле 1,2-дигидропроизводных 1,4-бенздиазепина наблюдается изменение хромофорной системы (увеличение сопряжения за счет лактим-лактамной таутомерии азометиновой связи в положения 1,2 - нитразепам, оксазепам).

Кислотный гидролиз хлордиазепоксида (I), протекающий в мягких условиях, приводит к образованию 4-окси-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-онов (II). В более жестких условиях эти соединения гидролизуются до 2-аминобензофенонов (III), альфа-аминокислот (IV) и аминов (V).

Метаболизм

Окисление

1.1. N-деметилирование

1. В молекуле диазепама у атома азота в 1 положении

2. В метиламинной группе хлордиазепоксида

 

 

Пробоподготовка.

Изолирование из тканей и органов трупа.

Анализ производных 1.4-бензодиазепина по нативным соединениям.

Возможно использование любых общих методов пробоподготовки.

 

· М-д изолирования нейтральным ацетоном

Биоматериал + н-ацетон à ацетоновое извлечение + 0,5н HCL + н-гексан à очищенная ацетоно-водная вытяжка àацетоно-водная фаза + NaOH + эфир à эфирное извлечение à ТСХ, элюирование à исследование не бензодиазепины.

· М-д Васильевой

Биоматериал + вода, подкисленная органической кислотой à водная вытяжка à водная фаза + NH4OH + хлороформ à органическая фаза à выпаривание à исследование на бензодиазепины

· М-д Стаса-Отто

Биоматериал + 96% этанол + органическая кислота à спиртовой экстракт à упаривание + 100% спирт à отделение осадка à очищенный экстракт à упаривание à остаток + горячая вода à фильтрование à водная фаза + NaOH + хлороформ à органическая фаза à исследование на бензодиазепины

ТСХ-скрининг

1. Общая система

НФ: силуфол

ПФ: хлороформ:этилацетат

Д:

· Р-в Драгендорфа

· Р-р FeCl3 + HCl + HNO3

 

2. Частная система

НФ: силуфол

ПФ: хлороформ:этилацетат:метанол

Д:

· Р-в Драгендорфа

· Р-р FeCl3 + HCl + HNO3

 

Обнаружение:

а) реактив Драгендорфа в разбавленной уксусной кислоте образует оранжевые и желто-оранжевые комплексные соли;

б) реактив FPN (хлорид железа (III) в смеси хлорной и азотной кислот) окисляет бензодиазепины с образованием окрашенных продуктов желтого цвета;

в) реактив Марки образует окрашенные продукты желтого цвета;

г) подкисленный йодплатинат образует темноокрашенные пятна.

 

Количественное определение

Для ГЖХ обнаружения производных 1,4-бензодиазепина и их метаболитов используется общая система: стеклянная колонка 2 м х 4мм с 2,5% SE-30 на хромосорбе Q.

Газ-носитель – аргон/метан

Температура колонки от 150 до 300 С

Температура инжектора – 230

Температура детектора - 300

Подготовка пробы: кровь/моча + вода + р-р NaHCO3 à центрифугирование à центрифугат à ТФЭ + вода à промывают картридж хлороформом à остаток растворяют в метаноле.

 

ГХ/МС анализ

Газовый хроматограф/ масс-спектрометр

Стандарты: смесь бензодиазепинов

Экстракция: пробирка + биожидкость + стандарт à встряхивают + NaCl + NH4Cl + н-бутилхлорид à экстракция à центрифугирование à органический слой + ацетонитрил + гексан à выпаривание à + этиловый эфир + KOH à центрифугирование à анализ

ВЭЖХ -анализ

Условия хроматографирования:

• хроматограф жидкостный

• ПФ: ацетонитрил:ацетатный буфер

• скорость потока элюирования - 100 мкл/мин

• детектирование - при длине волны 240 нм.

Подготовка пробы: моча + ацетат Na + b-глюкуронидаза à настаивание 2 часа + ацетатный буфер.

Приготовление стандартных образцов.

Для приготовления эталонных растворов используется чистые субстанции. Эти растворы служат для идентификации указанных веществ, определения их хроматографических параметров, а также для приготовления контрольных растворов при проведении количественных анализов.

Качественный анализ.

Идентификация проводится следующим образом:

• сопоставляют время удерживания и коэффициент емкости определяемого компонента и образца сравнения;

• сравнивают УФ-спектры предполагаемого компонента и образца сравнения;

• оценивают совпадение значений времени удерживания определяемого
компонента и образца сравнения при добавлении контрольного раствора в
раствор экстракта из биопробы (причем концентрация образца сравнения
должна быть близка к концентрации определяемого компонента);

• сопоставляют УФ-спектры определяемого компонента и образца сравнения при двух длинах волн, и оценивается их спектральное отношение.

Концентрация определяемого вещества (Ci) в растворе экстракта из биопробы определяется по формуле

где

C_k - концентрация "добавки" в растворе подвижной фазы;

V_k - объем добавленного контрольного раствора;

Vi- объем раствора экстракта с определяемым веществом;

hi - высота сигнала определяемого вещества в растворе экстракта из биопробы;

hi+k - высота сиrnала определяемого вещества после добавки в раствор экстракта

контрольного раствора.

Метод внешнего стандарта

В соответствии с методом внешнего стандарта и с учетом линейности зависимости выходного сигнала от массы вещества последовательно, с анализом раствора экстракта биопробы, проводят анализ контрольного раствора идентифицированного вещества. концентрация контрольного раствора (Ck) должна быть близка к концентрации определяемого вещества в растворе экстракта. Анализы контрольного раствора и экстракта биопробы должны проводитьсяв одном масштабе регистрации. Концентрация определяемого вещества в растворе экстракта (Ci) рассчитывается по формуле

Ci = Ck*hi/Hk, где Ck - концентрация контрольного раствора;

hi- высота сигнала определяемого наркотического вещества в

растворе экстракта биопробы; hk - высота пика вещества контрольного раствора.

Метод внутреннего стандарта

В соответствии с методом внутреннего стандарта в биообьект до операции пробоподготовки добавляется известное количество вещества, принятого за стандарт. Это вещество должно полностью отделяться от других компонентов образца, элюироваться близко к пику анализируемого соединения, не реагировать с другими компонентами, т.е. удовлетворять требованиям, предъявляемым к внутреннему стандарту. Можно использовать одновременно два и более внутренних стандарта. Концентрация определяемогo вещесгва (CI) рассчитывается по формуле

Ci = Cbc * Hi /Hbc *1/Fi/bc, где Свс - концентрация внутреннего стандарта;

hi - высота пика (или площадь) определяемого вещества; h_вс - высота пика (или площадь) стандарта; Fi/вc - относительный калибровочный фактор.

Относительный калибровочный фактор компонента Fi/вc вычисляется по формуле

Fi/bc = Hi * Cbc/Ci * Hbc, где hl- высота пика (или площадь) компонента известной концентрации (калибровочный раствор); CI - концентрация калибровочного раствора определяемого компонента; h_вс - высота пика (или площадь) внутреннего стандарта;

Сbc - концентрация внутреннего стандарта

 

Изучив отечественные и зарубежные литературные источники, описывающие различные инструментальные методы анализа группы производных бензодиазепина, а также опираясь на результаты наших исследований мы пришли к выводу, что оптимальной комбинацией в анализе производных бензодиазепина является применение в качестве:

• предварительного метода анализа – метод ПФИА с использованием пороговой концентрации 100 нг/мл,

• подтверждающего метода анализа – метод газовой хроматографиии с масс селективным детектором или газовой хроматографии с электронно-захватным детектором,

• метода количественного определения – высоко-эффективная жидкостная хроматография с диодно-матричным детектором.

Хлордиазепоксид (элениум, хлозепид)

Практически нерастворим в воде, растворим в воде соли 1,4-бенздиазепинов. В органических растворителях растворимость зависит от структуры. Наиболее высокая растворимость наблюдается в апротонных растворителях (диметилформамиде, диметилсульфоксиде). Слабое основание. pKa = 2.93

Выводятся производные 1,4-бенздиазепина, в основном, почками в виде основных соединений и метаболитов. Наличие в органах активных метаболитов производных 1,4-бенздиазепина снижает скорость элиминации. Время полувыведения (Т ½) 8-28 часов.

Хлордиазепоксид относится к транквилизаторам. Он оказывает успокаивающее действие на центральную нервную систему, обладает противосудорожной активностью, потенцирует действие снотворных веществ и анальгетиков, проявляет умеренный снотворный эффект.

Хлордиазепоксид (7-хлор-2-метиламино-5-фенил-ЗН-1,4-бензодиазепин-4-оксид) быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта. Метаболитами хлордиазепоксида является N-деметилхлордиазепоксид и лактам (7-хлор-1,3-дигидро-5-фенил-2Н-1,4-бензодиазепин-2-он-4-оксид). Часть неизмененного хлордиазепоксида и его метаболитов выделяется с мочой, а часть — образует конъюгаты, которые тоже выделяются с мочой.

 

Пробоподготовка.

· 25 г измельченного биологического материала + вода + HCl до рН = 1 à 3 раза по одному часу à вытяжки центрифугируют à центрифугат подщелачивают до рН = 10 + хлороформ à 3 раза взбалтывают àхлороформные вытяжки соединяют à обнаружение и количественное определение хлордиазепоксида.

· 5 - 10 мл плазмы крови или мочи + аммиак à дважды взбалтывают с хлороформом à хлороформные вытяжки + вода àвзбалтываютà хлороформный слой + 5 мл р-ра соляной кислоты à взбалтывают 5 минà солянокислые вытяжки отделяют à нагревают на водяной банеà затем нагревают при 125 °С на парафиновой бане 30 мин (при этом образуется 2-амино-5-хлорбензофенон)à + 0,5 мл 10 %-го р-ра нитрита натрия + 0,5 мл 0,5 %-го раствора сульфамината аммония + 0,5 мл 0,1 %-го раствора N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлоридаà вишнево-красная окраска.

 

Цветные реакции.

1. Реакция с нингидрином, хлордиазепоксид дает коричневую окраску.

2. Реакция с реактивом Марки, хлордиазепоксид дает желтую окраску.

3. Реакция с реактивом Фреде, хлордиазепоксид дает оранжевую окраску.

4. Реакция Витали — Морена, хлордиазепоксид дает желтую окраску.

 

 

ТСХ-обнаружение

Обнаружение хлордиазепоксида методом хроматографии в тонком слое сорбента.

НФ: силикагель КСК или пластинки «силуфол»

ПФ: этилацетат: 25 %-го р-р аммиака: метиловый спирт

хлороформ: ацетон

Д: р-в Драгендорфа

 

Использование спектров.

5. Обнаружение хлордиазепоксида по УФ- и ИК-спектрам. Хлордиазепоксид в 0,1 н. растворе гидроксида натрия имеет максимумы поглощения при 243 и 260 нм; в 0,1 н. растворе серной кислоты хлордиазепоксид имеет максимумы поглощения при 245 и 306 нм.

6. Хлордиазепоксид в 0,1 н. растворе соляной кислоты имеет максимумы поглощения при 246 и 308 нм.

 

Диазепам (седуксен)

Диазепам (седуксен, эридан,реланиум и др.) представляет собой белый или белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок, не растворяется в воде, трудно растворяется в этиловом спирте, растворяется в хлороформе.

Т1/2 = 20-55 часов.

По действию на организм диазепам относится к транквилизаторам. Он способствует нормализации сна, применяется для лечения невротических состояний, уменьшает чувство страха и т. д.

Диазепам быстро всасывается в пищевом канале.

Метаболизм:

· образуются продукты N-деметилирования à оксазепам à глюкуронид

· гидроксилирование диазепама à глюкуронид

Выделение из крови и мочи.

10 мл мочи/5 мл крови + равный объем фосфатного буферного раствора (рН = 7,0)à 2 раза по 5 мин взбалтывают с диэтиловым эфиром à эфирные вытяжки + NaOH à дважды взбалтываютà + вода à эфирная вытяжка + HCl à встряхивание 10 мин à отделение солянокислой вытяжки à ФЭК

Параллельно измеряют оптическую плотность диазепама, обработанного указанным выше способом. Наличие максимумов поглощения при 242 и 287 нм указывает на наличие диазепама в крови или моче.

Качественные реакции.

· Реакция с нингидрином. Р-р диазепама в этиловом спирте + 10 мг нингидрина à водяная баня + 5 мл этилового спирта à синяя окраска + 1 %-го раствора сульфата меди àкрасная.

ТСХ-обнаружение.

НФ: силикагель КСК/силуфол

ПФ: этилацетат: р-р аммиака: метиловый спирт

хлороформ: ацетон

Д: реактив Драгендорфа.

Спектральный анализ.

Диазепам в 2 н. растворе соляной кислоты имеет максимумы поглощения при 242 и 287 нм, в 0,1 н. растворе серной кислоты имеет максимумы поглощения при 241, 284 и 359 нм; в ИК-области спектра диазепам имеет основные пики при 1681, 1484 и 1313 см -1.

Оксазепам

 

Т1/2 = 5-15 часов.

 

Он представляет собой кристаллический порошок, почти не растворимый в воде, растворимый в этиловом спирте и хлороформе.

По фармакологическим свойствам оксазепам близкий к хлордиазепоксиду и диазепаму. Он менее токсичен, чем диазепам, обладает слабым противосудорожным действием и миорелаксантным эффектом.

Метаболизм. Оксазепам явдяется одним из метаболитов диазепама. После приема оксазепама максимальный уровень его в плазме достигается через 4 ч, а через 48 ч он исчезает из плазмы. Оксазепам находится в плазме в виде глюкуронида. В виде глюкуронида он выделяется с мочой, а с калом он выделяется в неизмененном виде.