Выделение из биологического материала

25 г исследуемого объекта + 3 мл насыщенного р-ра гидрофосфата натрия àuомогенизирование à гомогенат + 100 мл диэтилового эфира à взбалтывают à эфирные вытяжки соединяют à фильтруют через бумажный фильтр à профильтрованные эфирные вытяжки à обнаружение и количественное определение оксазепама.

 

Выделение из крови и мочи.

10 мл крови/мочи + 100 мл диэтилового эфира à взбалтывают 10 мин, 2 раза àотделяют эфирную вытяжку à фильтруют через бумажный фильтр à профильтрованные эфирные вытяжки à обнаружение и количественное определение оксазепама.

Качественные реакции.

 

Цветная реакция

25—50 мл объединенной эфирной вытяжки à выпаривают досуха à сухой остаток растворяют в 5 мл 6 н. раствора соляной кислоты и фильтруют à 1 мл фильтрата кипятят 5—10 мин à помещают в холодильник на 15 мин à + 1 мл смеси (0,3 г бромида калия, 0,3 г нитрита натрия в 6 мл воды) à взбалтывают и помещают в холодильник на 30 мин à + 0,5 мл 10%-го раствора мочевины à + 1 мл 1 %-го спиртового раствора α-нафтола и 1 мл 40 %-го водного раствора гидроксида натрия à красная окраска

ТСХ-обнаружение.

НФ: силуфол

ПФ: хлороформ: пропиловый спирт: ацетон

Д: тиосульфат натрия.

При налички оксазепама на пластинке появляются оранжевые или желтоватые пятна.

 

Обнаружение по УФ- и ИК-спектрам.

Растворы оксазепама в этиловом спирте имеют максимумы полос поглощения при 230 и 315 нм. В ИК-области спектра оксазепам (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1687, 1706, 693 и 830 см -1.

Нитразепам

 

T1|2 = 18-38 часов.

Нитразепам — светло-желтый или светло-желтый с зеленым оттенком кристаллический порошок. Практически нерастворим в этиловом спирте и хлороформе.

Нитразепам оказывает транквилизирующее, мышечно-расслабляющее, снотворное действие и т. д. Он усиливает снотворное действие других снотворных средств и анальгетиков. Применяется при нарушении сна, неврозах, психопатиях.

Метаболизм. Метаболитами нитразепама являются 7-амино-метаболит, 7-ацетиламино-метаболит. В течение 48 ч из организма выделяется около 23 % принятой дозы нитразепама. В неизмененном виде с мочой выделяется около 5 % этого препарата. Свыше 8 % нитразепама выделяется с мочой в виде 7-амино- метаболита и около 10%—в виде 7-ацетиламино-метаболита. Часть неизмененного нитразепама может быть обнаружена в кале.

 

Выделение из биологического материала.

Биологический материал трижды настаивают с насыщенным раствором щавелевой кислоты (рН=1) à Через 1 ч после каждого настаивания вытяжки отделяют от биологического материала центрифугированием à кислый центрифугат трижды взбалтывают со смесью хлороформа и этилацетата à кислый центрифугат подщелачивают до рН = 10 à трижды взбалтывают с новыми порциями смеси хлороформа и этилацетата à исследование на наличие нитразепама.

 

Предварительные пробы на наличие в моче.

5 мл мочи + аммиак до рН=10 + 250 г дитионита натрия (Na2S2O4) à взбалтывают 10 мин à нагревают при 50 °С в течение часа и охлаждают à жидкость 10 мин взбалтывают с 10 мл смеси (метиленхлорида и этилацетата) à от водной фазы отделяют слой смеси органических растворителей à взбалтывают с 10 мл 5 %-го раствора буры à фаза органических растворителей à + 5 мл 0,2 н. раствора соляной кислоты à взбалтывают à органические растворители.

4 мл кислой водной фазы охлаждают в ледяной воде + 0,2 мл 0,4 н. раствора нитрита натрия à + 0,2 мл 2%-го раствора сульфамината аммония à перемешивают à + 0,2 мл 0,4 %-го раствора N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорида à вишнево-красная окраска.

Выделение метаболитов нитразепама из мочи.

5 мл мочи + аммиак до рН=10 à взбалтывают 10 мин à нагревают при 50 °С в течение часа и охлаждают à жидкость 10 мин взбалтывают с 10 мл смеси (метиленхлорида и этилацетата) à от водной фазы отделяют слой смеси органических растворителей à взбалтывают с 10 мл 5 %-го раствора буры à фаза органических растворителей à + 5 мл 0,2 н. раствора соляной кислоты à взбалтывают à органические растворители.

4 мл кислой водной фазы охлаждают в ледяной воде + 0,2 мл 0,4 н. раствора нитрита натрия à + 0,2 мл 2%-го раствора сульфамината аммония à перемешивают à + 0,2 мл 0,4 %-го раствора N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорида à вишнево-красная окраска.

 

Обнаружение нитразепама и его метаболитов методом хроматографии.

ПФ: силикагель/силуфол

НФ: этилацетат: метилен: аммиак

Д: р-в Драгендорфа

Обнаружение по УФ- и ИК-спектрам.

Раствор нитразепама в этиловом спирте имеет максимумы поглощения при 218 и 260 нм, в 0,1 и. растворе серной кислоты имеет максимум поглощения при 277 нм и изгиб около 340 нм; нитразепам в ИК-области спектра (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1692, 1615, 1352 и 702 см -1.

ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНИЛАЛКИЛАМИНА

Изолирование

1. М–д Васильевой.

Биоматериал + вода + органическая кислота à водная вытяжка + NH4OH + хлороформ à органическая фаза à выпаривание à анализ

2. М-д Стаса-Отто

Биоматериал + 96% этанол + органическая кислота à спиртовой экстракт àупаривание + 100% этанол à осаждение белков à отделение осадка à очищенный экстракт à упаривание à сухой остаток + горячая вода à фильтрование + NH4OH + хлороформ à органическая фаза à анализ

3. М-д Крамаренко

Биоматериал + вода + серная кислота à водная вытяжка + электролит à осаждение белка à отделение осадка à очищенная водная вытяжка + эфир (доп. очистка) + NaOH до рН = 8-9 + хлороформ à органическая фаза à анализ

4. Изолирование н-ацетоном

Биоматериал + ацетон à ацетоновое извлечение + н-гексан + Hcl à очищенная фаза à + NH4OH + эфир à эфирное извлечение à ТСХ, элюирование à анализ

 

Обнаружение амфетаминов.

ТСХ

НФ: силикагель

ПФ: хлороформ: ацетон: этанол: аммиак

Д: р-в Марки à окраска

 

Дериватизация: сухой остаток + толуол + дериватизирующий реактив à темп. 60 С 30 мин. + NaH2CO3 à центрифугирование

 

Количественное определение.

 

Выбор условий разделения

Для разделения фенилалкиламинов методом ВЭЖХ рекомендуются следующие условия:

—- хроматографическая колонка (62 х 2 мм), заполненная обращенно-фазным сорбентом "Сепарон" Cie (5мкм) (колонка постав­ляется с хроматографом);

— в качестве подвижной фазы (элюента) для разделения фенилалкиламинов используется смесь водного раствора ортофосфорной кислоты (0,2 М), метанола и диэтиламина (75:20:1). Добавление диэтидамина улучшает форму пиков и позволяет сократить время анализа;

— детектирование фенилалкиламинов проводится при 210 нм;

— скорость элюирования — 50 мкл/мин.