Фотометрия в УФ-области спектра

Этот метод требует высокой степени очистки извлечения и обычно сочетается с ТСХ. Измерение проводят при λ_мах 250-255нм в раствора 0,5 н. H₂SO₄.

 

Выделение из биологического материала (метод Соломатина)

с оединения основного характера

Биоматериал + 100% этанол + щавелевая кислота до рН = 2-3 à образование растворимых в воде оксалатов фенотиазинов à настаивают 3 раза по 2 часа à вытяжка à упаривание + 100% спирт à очищенный от белков раствор à упаривание + вода à фильтрование à очищенный раствор + эфир à органическая фаза à исследование на фенотиазины.

 

Изолирование из мочи и крови

Раздельно 5-10 мл мочи и 2 мл крови + 50% NaOH до рН 13 à 10 минут на водяной бане à гидролизат à охлаждается до комнатной температуры и дважды извлекается н-гептаном, содержащим 3% изоамилового спирта à промывают водой, насыщенной гептаном и делят на две равные части à в одной части проводится обнаружение производных фенотиазина методом тонкослойной хроматографии, а в другой – количественное определение.

Экстракт из крови полностью расходуется на количестввенное определение, т.к. содержит меньшее количество соэкстрактивных веществ.

Хроматографичесткая очистка и обнаружение в тонких слоях

Из аликвоты органического экстракта удаляют в токе теплого воздуха органический растворитель. Сухой остаток + хлороформ à

НФ: Силуфол

ПФ: бензол: диоксан: аммиак ЛИБО этилацетат: ацетон: аммиак

В качестве метчиков наносят аминазин (обязательно) и те производные фенотиазина, которые были обнаружены в процессе предварительного исследования.

Д: одну пластинку опрыскивают раствором конц. H₂SO₄ в этаноле (1:9) и при положительном результате на второй пластинке обнаружение проводят прокапыванием реактивом Марки.

ТСХ-скрининг

Общая система

НФ: силикагель КСК

ПФ: ацетон: хлороформ: аммиак: диоксан

Д: 57% раствор HClO4 + 0.5% NaNO2 à розово-фиолетовый

Частная система

НФ: силикагель КСК

ПФ: ацетон: хлороформ

Д: 57% раствор HClO4 + 0.5% NaNO2 à розово-фиолетовый

Качественное обнаружение.

1. С растворами йодида висмута в йодиде калия и фосфорно-молибденовой кислоты получаются аморфные осадки.

2. С концентрированной серной кислотой возникает устойчивое пурпурно-красное окрашивание.

3. С формалинсерной кислотой аминазин дает пурпурно-красное окрашивание, усиливающееся при стоянии.

4. С концентрированной азотной кислотой возникает быстро исчезающее пурпурно-красное окрашивание.

5. С 5% раствором золотохлористоводородной кислоты (после 3—4-кратной обработки остатка основания аминазина 0,1 н. раствором НС1) выделяется темно-красный аморфный осадок, переходящий через 20-50 минут в характерный кристаллический.

Обнаружение фенотиазинов.

Фенотиазины часто обнаруживают с помощью тонкослойной хроматографии щелочных экстрактов мочи, но при пероральном поступлении в организм специфическая идентификация этого соединения может оказаться невозможной, если для анализа имеется

только моча. Фенотиазины, принимаемые в низких дозах, например флуфеназин, невозможно обнаружить в моче ни одним из известных методов.

 

Качественный анализ

 

а) Реакции осаждения

+общеалкалоидные осадающие реактивы (часто реактив Драгендорфа) +соль Рейнеке, Bi, Au

б) Микрокристаллические реакции

+5% раствор хлорного золота дает характерные кристаллические осадки +соль Рейнеке дает характерные кристаллические осадки

4) окисление солями металлов, имеющих высшую степень окисления (FeCl₃ и
HPtCl₄). В основе теста лежит реакция многих из этих соединений с ионами трехвалентного железа в кислой среде. Предпринимается для исследования мочи, содержимого желудка и остатков веществ с места происшествия.

а)Реактив FPN (FeCl₃+ HClO₄+ HNO₃), Цвета, варьирующиеся от розового, красного или оранжевого до фиолетового или синего, могут свидетельствовать о присутствии фенотиазинов или их метаболитов. Моча пациентов, регулярно принимающих в лечебных целях традиционные фенотиазины, например хлорпромазин, обычно дает положительную реакцию. Чувствительность Хлорпромазин, 25 мг/л.

б)Элениум + HPtCl₄ → фиолетовый осадок; Тиоридазин – серо-розовый осадок; Левомепромазин –ярко-зеленое окрашивание.

Количественное определение

Количественное определение производных фенотиазина проводится без предварительной хроматографической очистки и разделения только в случае, когда установлено отсутствие в биообъекте других веществ основного характера. При их наличии для количественного определения производных фенотиазина проводят хроматографическую очистку методом ТСХ. Для этого на хроматографическую пластинку на стартовую линию, наносят в виде сплошной полосы шириной 1 см всю аликвоту экстракта для количественного определения и хроматографируют. По окончании хроматографирования в УФ-свете отмечают зону соединения с соответствующим Rf, параллельно метчикам, снимают слой сорбента, содержащего соединение скальпелем в пробирку. Элюирование проводят 10 мл раствора 25% аммиака в этаноле (1:1) элюат отделяют фильтрованием через стеклянный фильтр № 4, упаривают досуха в токе холодного воздуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл 0,1 н раствора HCl, затем добавляют 4 мл 0,01 н НCl.

В случае отсутствия других веществ основного характера вторую часть гептанового извлечения (кровь, моча) реэкстрагируют 5 мл 0,1 н. HCl, а затем 4 мл 0,01 н НCl. Солянокислые растворы объединяют.

К объединенному солянокислому раствору добавляют 12 мл ацетатного буферного раствора (рН 3,5), 2 мл насыщенного раствора метил-оранжа и 5 мл хлороформа. Полученная смесь взбалтывается в делительной воронке – при наличии производных фенотиазина хлороформный слой окрашивается в желтый цвет (гелиантаты производных фенотиазина, извлекаемые хлороформом). Хлороформный слой отделяется и определяется оптическая плотность окрашенного раствора (фотоэлектроколориметр ФЭК-56 и др., кювета 10 мм, светофильтр синий с максимумом пропускания при 400 нм).

Для построения калибровочной кривой готовят стандартные растворы в 0,01 н НСl производных фенотиазина с содержанием 1_,2-10 мкг/мл производных: фенотиазина и исследуют их вышеприведенной процедурой. На основании результатов определения оптической плотности строится калибровочный график. Вышеприведенным методом изолируется до 60% производных фенотиазина из крови и до 80% из мочи.

 

Аминазин

Аминазин (хлорпромазин, плегомазин, хлоразин, ларгактил и др.) представляет собой белый или бе­лый с кремоватым оттенком мелко­кристаллический порошок. Ами­назин гигроскопичен, темнеет под

влиянием света, хорошо растворяется в воде, этиловом спирте и хлороформе. Он практически не растворяется в диэтиловом эфире. Растворы аминазина имеют кислую реакцию.

Аминазин экстрагируется органическими растворителями из щелочных растворов.

Он оказывает сильное седативное действие. При больших дозах аминазин вызывает сон. Он усиливает действие снотворных, наркотических и местноанестезирующих веществ. Аминазин имеет противорвотное действие и успокаивает икоту. Он уменьшает проницаемость сосудов, сни­мает страх, тревогу, напряжение у больных психозами и невро­зами.

Метаболизм аминазина:

· Гидроксилирование

· Сульфоокисление

· N-деметилирование

· разрыв боковой цепи

 

Аминазин всасывается преимущественно из кишечника. Локализуется в тканях мозга, печени, почек. Главными метаболитами аминазина у человека являются: 7-оксипроизводное, десмонометиламиназин и соответствующие сульфоксиды указанных метаболитов. Перечисленные выше ме­таболиты выделяются с мочой. Некоторое количество этих мета­болитов выделяется с мочой в виде комъюгатов с сульфатами и глюкуроновой кислотой. С мочой выделяется и часть неизменен­ного аминазина.

 

Объекты:

1. Промывные воды желудка (если токсикант был принят внутрь, то промывные воды
будут содержать его следы);

2. Желудок с содержимым, кишечник с содержимым (обнаруживаются остатки
токсиканта, не успевшие всосаться в кровь);

3. Части печени, почек (аминазин метаболизируется в печени, частично выводится
почками).

 

Выделение аминазина из биологического материала (по Б. М. Саломатину).

 

100 г измельченного биологического мате­риала + этиловый спирт, подкис­ленным 10% р-м щавелевой кислоты до рН = 2...3. à кислые спиртовые вытяжки на водяной бане (при 40 °С) упаривают до густоты сиропа à + 96° этиловым спиртом à фильтруют à выпаривают досуха + 100 мл воды (темп. 40—60 °С) à жидкость охлаждают и фильтруют à + 5 % р-р щавеле­вой кислоты до рН = 2...3 + диэтиловый эфир (по 50 мл 2 раза) + 50%-м р-м гидроксида натрия до рН = 13 + 4 порции диэтилового à объединенные эфирные вы­тяжки + 0,5 н р-р серной кислоты à водные вытяжки соединяют и нагревают 3 мин на водяной бане (темп. 50—60 °С) à кислые водные вытяжки используют для обнаружения аминазина.