Выяснение локализации путем повреждений

Видимая несостоятельность гипотезы Харкер о том, что у таракана надглоточный ганглий содержит циркадианный колебатель, контролирующий ритм активности, побудила начать поиски в других отделах центральной нервной системы. В 1968г. Нисиицуцудзи-Уо и Питтендрих стали исследовать зрительные доли мозга. По их данным, полное удаление этих структур или перерезка зрительного тракта вызывает стойкую аритмию, но не оказывает заметного влияния на общий уровень активности. Авторы высказали предположение, что эти структуры содержат колебатель, контролирующий ритм подвижности. Лоэр наблюдал сходный эффект на сверчках. Он нашел, что двустороннее удаление зрительных долей у Те1еоgryllus commodus совершенно расстраивает ритм стрекотания, а позднее было показано, что при этом исчезают также циркадианные ритмы образования сперматофоров и подвижности. Эти результаты не позволяли определенно утверждать, что зрительные доли содержат колебатель, а лишь указывали на то, что они необходимы для поддержания ритма. В последних экспериментах удалось более точно локализовать нужные для этой функции клетки и установить, что они участвуют в работе колебателя.

Как у сверчка, так и у таракана одностороннее удаление зрительной доли не уничтожает ритмичности. Роберте и Соколов использовали этот факт для уточнения локализации предполагаемого колебателя в зрительной доле таракана. Роберте удалял у тараканов Leucophaea maderae и Рeriplaneta americana одну зрительную долю целиком, а от другой отсекал различные участки. Он нашел, что наиболее дистальная часть нейропиля (1аminа) не существенна для поддержания свободнотекущего ритма. Однако более проксимальные разрезы, удалявшие medulla, неизменно приводили к утрате ритма. Удаление части medulla давало промежуточные результаты: одна особь оказалась явно ритмичной, 7 – явно аритмичными, а у 17 ритм проявлялся недостаточно четко. Роберте получил сходные результаты и при электролитическом разрушении тканей; он пришел к выводу, что «для нормального свободнотекущего ритма необходим интактный комплекс «medulla-lobula». Соколов опубликовал аналогичную работу с электролитическим разрушением небольших участков у Leucophaea. Подобно Робертсу, он установил, что разрушение 1аminа не сказывается на ритме; однако и после разрушения medulla только 3 насекомых из 31 стали явно апериодичными. С другой стороны, повреждение вентральной половины доли вблизи второй зрительной хиазмы и lobulа часто приводило к утрате ритма. Соколов высказал предположение, что решающую роль играют тела нейронов в этом участке мозга и что при хирургических манипуляциях Робертса повреждались именно эти нейроны.

Более точная локализация участка зрительной доли, играющего роль в поддержании ритмичности, все же не исключала возможности того, что эти клетки необходимы только для проявления ритма, но не составляют самого колебателя. Однако в двух недавних исследованиях были получены веские данные в пользу того, что зрительные доли действительно участвуют в работе колебателя. Хотя для поддержания ритма достаточно всего одной доли (левой или правой), удаление второй ведет, как правило, к удлинению свободнотекущего периода, тогда как контрольная операция, например перерезка зрительного нерва, не влияет на период. Кроме того, с помощью электролитического разрушения тканей было показано, что участок зрительной доли (вентральный, вблизи lobulа), необходимый для поддержания ритмичности, в то же время содержит клетки, обеспечивающие нормальную величину свободнотекущего периода. Тот факт, что и наличие ритма, и его нормальный период зависят от одних и тех же клеток, позволяет думать, что эта область зрительной доли содержит, по меньшей мере, часть колебательной системы, контролирующей ритм подвижности таракана.

Хотя данные, подтверждающие участие зрительных долей в работе колебателя, весьма убедительны, повреждение других отделов мозга тоже может вызывать аритмичность; роль этих отделов в создании циркадианных колебаний остается неясной. Особый интерес представляет раrs intercerebralis: разрушение этой области у таракана часто приводит к утрате ритма подвижности, а у сверчка устраняет ритмы образования сперматофоров, стрекотания и подвижности. Остается неясным, отражают ли эти результаты участие pars intercerebralis в порождении циркадианных колебаний, или же эта область всего лишь связывает колебатель с наблюдаемыми ритмами (что считают более вероятным),ее возможная роль в контроле наблюдаемых ритмов подробнее обсуждается в следующем разделе.

Ряд исследований был проведен с целью локализовать колебатели, контролирующие циркадианный и приливный ритмы у десятиногих раков. Первые результаты указывали на роль глазных стебельков в контроле локомоторной активности. В этих структурах расположена значительная часть фотоцеребрума (зрительных долей), а также находится важный нейросекреторный комплекс, состоящий: из органов X и синусной железы.

Нейлор и Уильяме показали, что у краба Сarcinus удаление глазных стебельков неизменно приводит к исчезновению приливного ритма активности. Кроме того, сразу после операции наблюдался период повышенной активности (длительностью около 12 ч), после чего активность падала ниже нормального уровня. Кроме того, эти авторы обнаружили интересный факт: у интактных животных после затухания приливного ритма в постоянных условиях ритмичность восстанавливается под действием холода (10 – 12 ч при 4°С). Более того, возобновление ритма можно вызвать локальным охлаждением одних только глазных стебельков, тогда как после их удаления охлаждение уже не оказывает никакого действия. Эти результаты допускают несколько разных объяснений, и авторы отнеслись к их интерпретации с осторожностью.

Большую часть результатов, полученных на десятиногих раках и крабах, можно объяснить с помощью простой схемы, согласно которой колебатель находится в надглоточном ганглии, а структуры глазных стебельков служат одним из главных проводящих путей от колебателя к наблюдаемым ритмам. Однако при этом остаются без объяснения три факта: 1) сокращение свободнотекущего периода у Gecarcinus после удаления глазных стебельков; 2) существенное влияние этой операции на захватывание ритма у Рrocambarus сlarkii, особенно на фазу в устойчивом состоянии; и, наконец, 3) сохранение ритма миграции ретинальных пигментов у рака с удаленным мозгом и ритма амплитуды электроретинограммы в изолированных глазных стебельках. Первые два наблюдения, вероятно, проще всего объяснить, предположив, что какой-то из колебателей циркадианной системы расположен в глазных стебельках; из третьего факта это предположение вытекает с необходимостью.

Циркадианный ритм частоты составных потенциалов действия, наблюдаемый в изолированном глазу Аplysia лучше всего показывает, что ограниченная часть нервной системы способна функционировать как автономный циркадианный колебатель. Тот факт, что у Аplysia имеется также циркадианный ритм подвижности, позволяет поставить вопрос о значении глазного осциллятора для поведенческого ритма; ясного ответа на этот вопрос еще нет.

Арlysia californica – в основном дневное животное. Если его содержать при режиме СТ 12:12, то большая часть активности приходится на светлый промежуток, хотя часто некоторая активность наблюдается и незадолго до включения света. При коротком фотопериоде (СТ 8:16) начало активности опережает рассвет по фазе на 4 ч. Ликки и др. обнаружили, что после хирургического удаления глаз предрассветная активность исчезает, а начало главного пика активности точно совпадает с моментом включения света. Однако дневной тип активности сохраняется – по-видимому, неопределенно долгое время.

Множественные колебатели

Циркадианная система у беспозвоночных состоит из нескольких осцилляторов. Существование двусторонних парных осцилляторов бесспорно у Арlуsia, у которых любой из двух глаз, будучи изолирован, может самостоятельно поддерживать циркадианный ритм. Данные, полученные на таракане, также указывают на двустороннюю парную колебательную систему: каждая из двух зрительных долей независимо от другой, способна поддерживать ритмичность,

Все это указывает на то, что для циркадианных систем беспозвоночных характерны и подлинно множественные (в отличие от двусторонних отнюдь не «избыточные» - как функционально, так и анатомически) колебатели. Например, у Ар1уsia помимо глазных осцилляторов существует, еще один осциллятор, расположенный в абдоминальном ганглии. У рака два отдельных осциллятора находятся в абдоминальном ганглии и глазных стебельках; еще один имеется в надглоточном ганглии. Наконец, у, тараканов и сверчков, есть циркадианный колебатель, находящийся вне зрительных долей.

Таким образом, у всех беспозвоночных, у которых основательно изучали локализацию биологических часов (за исключением бабочек-сатурний), были обнаружены системы из нескольких «неизбыточных» циркадианных колебателей. В связи с этим возникает ряд вопросов об организации циркадианной системы у этих организмов, а также вообще у многоклеточных. Вероятно, один из важнейших вопросов состоит в следующем: отражает ли «остаточная» ритмичность, часто наблюдаемая после удаления предполагаемого ведущего осциллятора, присутствие еще какого-то колебателя – существенного компонента биологических часов – или же это просто результат способности многих клеток или тканей совершать циркадианные колебания при благоприятных условиях? Если эти «остаточные» колебатели действительно играют важную роль в деятельности циркадианной системы, то являются ли они вторичными подневольными осцилляторами, находящимися под иерархическим контролем со стороны первичного ведущего осциллятора, как в абстрактной модели циркадианной системы Drosophila?Или это компоненты составного колебателя, состоящего из разветвленной сети взаимно сопряженных осцилляторов?

В трех случаях наличие двусторонних циркадианных осцилляторов у животных с билатеральной симметрией позволило изучить взаимосвязь колебателен в многоосцилляторной системе. Были детально изучены два вопроса, касающиеся двусторонних колебателей. Во-первых, эквивалентны ли два колебателя, левый и правый, в функциональном отношении? И, во-вторых, связаны ли они таким образом, что образуют составной колебатель, который ведет себя как один осциллятор?

У Ар1уsiа одновременная запись электрической активности двух глаз показала, что оба ритма частоты составных потенциалов действия практически совпадают по фазе, периоду и профилю. У тараканов не удалось измерить периоды левого и правого колебателей одной и той же особи. Тем не менее длительное измерение свободнотекущих ритмов активности у насекомых с одной интактной зрительной долей показало, что по крайней мере в среднемпериоды левого и правого колебателей одинаковы – при 24,5°С они составляют около 23,95 ч. Хотя окончательные выводы пока преждевременны, все же эти данные позволяют думать, что такая пара анатомически избыточных колебателей функционально тоже избыточна, по крайней мере в первом приближении.

Хадсон и Ликки исследовали соотношение фаз свободнотекущих ритмов в двух глазах моллюска Ар1уsiа при постоянной темноте или очень слабом постоянном освещении. Разность фаз для пар глаз, извлеченных спустя 0 – 7 дней после помещения животного в постоянные условия, лежала в пределах от 0 до 1 ч, т. е. ритмы оставались – синхронными. Однако после 8 дней разность фаз в большинстве случаев составляла уже 10 – 12 ч. Лишь немногие пары глаз оставались почти согласованными. Ни в одном случае не было отмечено разности фаз от 4 до 7,5 ч. Можно думать, что имеются два стабильных соотношения фаз между глазными осцилляторами: либо в фазе, либо в противофазе, а это в свою очередь означает, что оба колебателя взаимосвязаны. Между тем было показано, что ритм одного глаза может быть легко рассогласован по фазе с ритмом другого in vivo путем воздействия световыми циклами на один глаз; по-видимому, два колебателя сопряжены – сравнительно слабо.

Гипотеза взаимного сопряжения колебателей существенно опирается на предположение, что клетки зрительной доли, участвующие в поддержании ритмичности, в то же время обеспечивают и сохранение нормального периода, а также захватывание второго, контралатерального колебателя. Это было показано в последующих экспериментах с небольшими электролитическими повреждениями. Достаточность одного сложного глаза для захватывания колебателя контралатеральной зрительной доли и сохранность нормального свободнотекущего периода зависят вентральной части зрительной доли от целости клеток вблизи lobulа (та же самая область необходима для под держания ритмичности). Эти результаты сильно подкрепляют представление о том, что клетки этого участка зрительной доли выполняют роль пары двусторонних колебателей, образующих взаимно сопряженную систему.

Результаты недавнего исследования указывают на то, что у жука В1арs gigas ритмы электроретинограммы двух глаз контролируются независимыми осцилляторами. Было показано, что в постоянной темноте эти ритмы имеют разные свободнотекущие периоды. Кроме того, фазу и период ритма одного из двух глаз можно задавать локальным освещением этого глаза (СТ или СС), и это вовсе не влияет на ритм второго глаза. Отсюда следует, что ритм каждого глаза контролируется своим, собственным колебателем и что оба колебателя либо независимы, либо связаны очень слабо. Десинхронизация колебателей у Ар1уsiа и В1арs наводит мысль, что эти организмы должны полагаться на ежедневные внешние сигналы, чтобы поддерживать нужное соотношение фаз между колебателями. Между тем в опытах с тараканами не было получено никаких указаний на то, что колебатели в зрительных долях способны к спонтанной десинхронизации или что их можно десинхронизировать с помощью одностороннего освещения. В этом случае синхронность, видимо, поддерживается путем взаимного захватывания колебателей в двух зрительных долях.