Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ:  Археология Биология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия ЭкологияТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву 
Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Применение ПЦР в клинической практике
Наиболее широко молекулярно-биологические методы используются в микробиологии, вирусологии и в онкологии. В микробиологии и вирусологии этим методом определяют клинически важные виды бактерий, грибов, вирусов, а также оценивают их вирулентность и устойчивость штаммов к лекарствам. Применение ПЦР как метода микробиологической диагностики имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами: · Прямое определение наличия возбудителей · Высокая чувствительность Чувствительность ПЦР тест-систем составляет 10–1000 клеток возбудителя в анализируемой пробе, в то время как чувствительность иммунологических, паразитологических тестов колеблется в пределах 103–105 клеток. Следует, однако, отметить, что высокая чувствительность ПЦР создает и определенные клинические проблемы. В частности, встает вопрос о клиническом значении выявляемых ПЦР чрезвычайно низких количеств патогена. Кроме того, метод ПЦР сложно использовать для мониторирования эффективности терапии, в связи с тем, что метод детектирует как живые, так и погибшие микроорганизмы. · Высокая специфичность Высокая специфичность метода обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида фрагмент ДНК либо РНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью специфических праймеров и специально отрабатываемыми жесткими условиями их присоединения или «отжига» к искомой молекуле ДНК. · Простота исполнения, возможность полной автоматизации и быстрота получения результатов · Использование для анализа непосредственно клинического и патологического материала Метод ПЦР позволяет проводить определение возбудителя заболеваний непосредственно в клиническом материале (кровь, мазки, смывы, соскобы, слюна, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок, биоптаты и т.д.). Для проведения анализа не требуется выделения и выращивания культуры возбудителя. · Малое количество используемого материала для исследований Количество исследуемого материала может составлять несколько десятков микролитров, так как в результате проведения ПЦР концентрация анализируемого участка ДНК (РНК) выявляемого возбудителя увеличивается в сотни и тысячи раз.
· Возможность выявления некультивируемых, труднокультивируемых или персистирующих форм патогенных организмов Особенно это важно при обследовании серонегативных пациентов на самых ранних стадиях развития патологического процесса, когда лечение наиболее эффективно. При диагностике с помощью ПЦР достигается размножение не тестируемого организма, а только специфического фрагмента его ДНК, являющегося маркерным для данного вида. · Исключение возможности инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его взятия, следовательно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР. В онкологии метод используется для поиска клинически значимых маркеров злокачественности и определения их количества у пациентов, для определения микрометастазов и минимальной остаточной болезни, а также для контроля за результатами терапии. Метод хорошо зарекомендовал себя как очень чувствительный (~1 раковая клетка на 106 нормальных клеток) и высокоточный метод для детекции раковых клеток в жидкостях организма. В акушерстве перспективно использование ПЦР в предимплантационной и пренатальной диагностике, скрининге новорожденных. В терапевтической практике – для оценки генетической предрасположенности к различным заболеваниям, генотипирования ферментов метаболизма лекарственных средств и выявления степени чувствительности или резистентности к определенным препаратам.
ПЦР в реальном времени Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR) – реакция, в ходе которой детекция продуктов ПЦР происходит непосредственно во время амплификации по мере накопления в каждом цикле, то есть в режиме реального времени. Преимущества real-time PCR: · возможность размещения в одной комнате; · исключение контаминации продуктами реакции; · снижение трудозатрат; · быстрота выполнения; · параллельная детекция до 4-х возбудителей в одном образце. Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный прибор, в котором одновременно проводится амплификация, гибридизация с флуоресцентным зондом и детекция результатов по флуоресцентному свечению метки.
Для детекции продуктов амплификации используют 2 основных подхода: · Интеркалирующие красители. Принцип – флуоресценция метки (бромистого этидия) значительно возрастает при внедрении в двойную цепь молекулы ДНК, а, следовательно, дает возможность наблюдать накопление продуктов амплификации. · Использование ДНК-зондов, в состав которых входят флюоресцентная метка и гаситель флюоресценции. Когда зонд находится в растворе, гаситель поглощает испускаемое меткой излучение и свечение отсутствует. Когда в ходе ПЦР происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, происходит разъединение метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения (рисунок 4.19). Чем больше ампликонов наработано, тем интенсивнее флюоресценция.
Рисунок 4.19 – Схема работы ДНК-зонда (пояснения в тексте) В настоящее время real-time PCR считается наиболее чувствительным способом для определения количества специфической нуклеиновой кислоты в сложном биологическом образце. Метод позволяет определять относительное и абсолютное количество последовательности-мишени в широком диапазоне (7–8 порядков величины в сравнении с 3–4 порядками для традиционной ПЦР) при общей продолжительности анализа от 30 мин до 2 ч.
ПЦР in situ Этот метод стал активно развиваться в последнее время, благодаря тому, что он, в отличие от ПЦР, проводимой в растворе, позволяет не только амплифицировать какую-либо последовательность ДНК, но и локализовать ее внутри клетки. По чувствительности метод сравним с ПЦР, проводимой в растворе. Исследование проводится с клеточным монослоем или срезом ткани, который после фиксации обрабатывают протеолитическими ферментами, а затем определяют продукты ПЦР. Метод очень перспективен в изучении латентных вирусных инфекций и оценке эффекта действия новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровне.
Приложение I
Перевод общепринятых единиц в единицы СИ (Меньщиков В.В., 2002)
Коэффициенты перевода единиц активности ферментов.
Приложение II ПЕРЕЧЕНЬ
(из Постановления Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 19 февраля 2008 г. № 38)
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
Последнее изменение этой страницы: 2016-08-01; просмотров: 520; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.144.97.189 (0.015 с.) |
