Способы измерений, расчета и представления результатов фотометрии

Способы измерений результатов реакции при проведении фотометрических исследований в клинических лабораториях:

· по конечной точке

· по фиксированному времени

· кинетически

Определение по конечной точке состоит в учете образования продукта за некоторое время (необходимое для того, чтобы реакция произошла). Расчет результатов производится по стандарту. Такой подход используется, например, для определения альбумина биуретовым методом, глюкозы глюкозооксидазным методом и т.д.

Оценка результатов по фиксированному времени предполагает установление количества нарабатываемого (или расходуемого) продукта за определенное (фиксированное) время с последующим расчетом концентрации по стандарту. Примером может служить определение мочевины уреазным методом.

Кинетический метод исследования, как правило, является ферментативным. Он требует применения специальных термостатируемых кювет для поддержания постоянной температуры анализируемой жидкости. В образце производят измерение оптической плотности в ходе реакции через определенные промежутки времени. Из полученных значений рассчитывают среднюю величину изменения абсорбции (∆) и с использованием определенных (соответствующих температуре инкубации) коэффициентов производят расчет результатов. Такой подход является оптимальным, особенно при определении активности ферментов.

Расчет результатов фотометрических измерений производится следующими основными методами:

1. Условные единицы (у.е.).

Это фактически непосредственное выражение единиц оптической плотности исследуемого раствора. Для удобства единицы оптической плотности умножают на коэффициент 100 или 1000 для выражения у.е. в больших целых числах. Например, сиаловые кислоты 130-200 у.е. соответствует коэффициенту экстинции 0,13-0,20, умноженному на коэффициент 1000.

2. Расчеты результатов исследований по стандартным (эталонным) растворам. Эталонные растворы обрабатываются параллельно с серией исследуемого биоматериала и находятся в тех же условиях, что исследуемый материал. Недостаток – повышенный расход реактивов и рабочего времени. Рациональность применения стандартных растворов определяется рамками реальной необходимости. Требуется строго подходить к подготовке эталонного раствора: из реактива квалификации не менее «хч», взвешивание на аналитических весах с высокой точностью (для флуориметрии, а для колориметрии можно на торсионных), растворение в мерной колбе. Концентрация вещества в эталонном растворе должна быть близка к нормальным значениям данного показателя в организме. Расчет исследований по стандартным растворам производится по способу простой арифметической пропорции: стандарт умножить на пробу разделить на стандарт.

3. Расчет результатов по калибровочному графику. Недостаток –ограниченное количество методик со стабильными условиями проведения и с хорошим подчинением результатов основному закону фотометрии. Тем не менее данный подход является одним из самых распространенных способов расчета результатов.

Калибровочные графики строятся для каждого фотометра отдельно. Перенос на другой аппарат недопустим даже в случае использования однотипных фотометров, так как у каждого аппарата свои технические особенности. Калибровочные графики проверяются не реже 1 раза в год.

Для построения калибровочного графика проводят исследование серии стандартных растворов, различающихся между собой концентрацией. Диапазон концентраций должен охватывать как значение физиологической нормы, так и наиболее вероятные пределы патологии для данного исследуемого компонента. Для приготовления стандартных растворов навески берутся только на аналитических весах, обязательно в параллелях (для снижения вероятности ошибок, связанных с погрешностями взвешивания), растворяются в мерной колбе.

Калибровочный график должен содержать:

¨ название метода исследования,

¨ заводской номер фотометра, к которому построен график,

¨ указать длину световой волны, толщину слоя кюветы,

¨ исходные данные для построения,

¨ дата построения.

4. Расчет результатов исследований с помощью коэффициента пересчета. Является наиболее простым и быстрым. Используется формула: С = F х Е, где С – концентрация исследуемого компонента, F – коэффициент пересчета, Е – экстинция. Недостаток данного подхода как в п. 3.

Коэффициент пересчета является величиной специфической для каждого отдельного теста и обычно указывается в описании метода исследования. Коэффициент можно рассчитывать самому на основании исследования стандартных растворов, но обязательно с выполнением методических требований, аналогичных таковым при исследовании биологического материала. За основу можно взять ранее построенный калибровочный график. Коэффициент требует проверки не реже 1 раза в год. Коэффициенты пересчета используются в анализаторах. Они вводятся в память компьютера и выдаются автоматически.

 

4.2. Иммунохимические методы анализа в клинической лаборатории

Иммунохимические методы исследований – методы, основанные на специфической реакции взаимодействия антигена с антителом. В связи с отличными аналитическими характеристиками (высокая чувствительность и специфичность) иммунохимические методы используются в ситуациях, когда необходимо определить концентрации веществ, содержащихся в очень низких концентрациях в биологическом материале. Так, они широко применяются для определения опухолевых маркеров, гормонов, цитокинов, лекарственных веществ и т.д.

Принципиальная схема иммунохимического анализа:

AГ + AТ = комплекс AГ-АТ

Целью анализа может быть детекция антигена в биоматериале, либо детекция антител. В первом случае тест-система должна иметь в своём составе соответствующее антитело (например, для определения концентрации дигоксина надо иметь в тест-системе антитела к нему). Во втором случае тест-система должна содержать в своём составе соответствующий антиген (например, для определении антител к НbSAg в тест системе должен содержаться синтетический HbSAg).

Для проведения иммунохимических реакций могут использоваться моноклональные или поликлональные антитела. Поликлональные антитела являются производными нескольких клеточных клонов и направлены против разных эпитопов одного и того же антигена. Их получают путем иммунизации животных антигенами.

Моноклональные антитела направлены к определенному эпитопу антигена. Они вырабатываются одним клоном, являющимся потомством одной исходной клетки. Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью действия, поэтому их применение в иммунохимических анализах является предпочтительным. Их искусственно получают в лабораториях с использованием гибридомной технологии.

Гибридомы представляют собой клоны клеток, полученных путем слияния антителообразующей клетки человека с опухолевыми клетками. Гибридная клетка получает от антителообразующей клетки способность продуцировать иммуноглобулины, а от опухолевой клетки – способность к самоподдержанию и неограниченному росту. Такая гибридная клетка, помещенная в питательную среду, размножается и вырабатывает в надосадочную жидкость антитела. В процессе культивирования проводят постоянный контроль антител на специфичность иммунохимическими методами. Полученные антитела являются молекулярно однородными и доступными для получения в относительно больших количествах.

В зависимости от технологии выполнения все иммунохимические методы подразделяются следующим образом:

1. Гомогенный иммунохимический анализ

Исследуемый образец смешивается с необходимыми реагентами. Об образовании комплекса АГ-АТ судят по появлению новых свойств метки (например, потеря активности). В процессе выполнения тестов, основанных на технологии гомогенного иммуноанализа, отсутствуют процедуры разделения между несколькими реакционными стадиями, что является их главной отличительной особенностью. Данные тесты выполняются относительно быстро.

2. Гетерогенный иммунохимический анализ

В этих методах один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксирован на твёрдой фазе. В процессе реакции, фиксированные антитела (или антигены) связываются с молекулами исследуемого антигена (или антител) пробы или с реагентом. Избыток реагентов или не связавшихся с фиксированными антителами антигенов пробы удаляют из реакционной смеси в процессе стадии отмывки, после которой детектируется меченый реагент,связанный с фиксированными на твёрдой фазе антителами. Следует отметить, что, благодаря стадии отмывки, представляется возможность устранить влияние на процесс анализа различных компонентов, содержащихся в исследуемой пробе. Таким образом, гетерогенные иммунохимические методы позволяют определять вещества в очень низких концентрациях. Технологические приёмы, используемые при постановке различных тестов, в основе которых лежит технология гетерогенного иммунохимического анализа, многообразны. Наиболее часто используют два основных подхода – конкурентный и неконкурентный иммуноанализ.

Конкурентный иммуноанализ (конкурентное связывание, сатурационный анализ) – вид исследования, основанный на конкурентном связывании некоторых веществ (лигандов) с анализируемым веществом и его меченым аналогом, добавленным извне. Они конкурируют за лиганд, который используется в таком количестве, чтобы его связывающая способность полностью насытилась (рисунок 4.5).

Рисунок 4.5 – Схема конкурентного иммунохимического анализа.

Антитела связаны с твердой фазой. На первом этапе фиксированные АТ инкубируют с анализируемым антигеном (сыворотка больного) и строго определенным количеством стандартного меченого АГ, которые конкурируют между собой за связывание с АТ. Несвязавшиеся антигены удаляют отмывкой (2). В результате реакции количество меченого антигена, связавшегося с фиксированными АТ обратно пропорционально концентрации исследуемого антигена пробы (3).

 

Исследование можно проводить и в другом варианте, когда с твердой фазой связан антиген. При этом на первом этапе реакции добавляют меченые АТ и исследуемую пробу (исследуемый антиген). Связывание меченых АТ с фиксированным на твердой фазе антигеном конкурентно тормозится тестируемым антигеном. Несвязавшиеся АГ и АТ удаляют отмыванием, а образовавшиеся на твердой основе комплексы АГ-АТ визуализируют в зависимости от типа метки (ферментная, радиоактивная и др.). Учет реакции аналогичен вышеописанному – чем выше в пробе пациента концентрация исследуемого антигена, тем ниже количество меченых антител связывается с адсорбированными на твёрдой фазе антигенами.

Конкурентный метод используют для детекции веществ, содержащихся в пробе в низких концентрациях, таких как кортизол, тироксин (Т4),лекарственные вещества (дигоксин и др.). Диапазон детекции – от 10^-6 до 10^-12 моль/л.

Сэндвич-метод применяется для определения концентрации субстратов с высокой молекулярной массой, являющихся достаточно большими для связывания по крайней мере с двумя антителами. Технология этого теста предусматривает использование двух антител, одно из которых связано с твёрдой фазой, а другое содержит ферментную метку (рисунок 4.6). В клинической практике данный подход используется для определения концентрации белковых гормонов, таких как ТТГ; опухолевых маркёров (раково-эмбриональный антиген), а также определения инфекционных маркёров (НвSАg и др.). Диапазон детекции от 10^-8 моль/л до 10^-13 моль/л.

 

А В

 

Рисунок 4.6- Схема иммунохимического анализа типа «сэндвич»

А – вариант метода с фиксированными на твердой фазе АТ. На первом этапе фиксированные АТ инкубируют с исследуемой пробой, содержащей антиген (например, сывороткой больного). Несвязавшийся антиген удаляют отмыванием (2) и добавляют меченые специфические антитела (3), избыток которых также удаляется отмыванием. В результате реакции количество меченых антител, связавшихся с твердой фазой, прямо пропорционально количеству антигена в анализируемой пробе.

В – вариант метода с фиксированным на твердой фазе стандартным антигеном. На первом этапе производят инкубацию с исследуемым материалом, содержащим искомые АТ. Несвязавшиеся АТ удаляют отмыванием (2). Добавляют меченые АТ против иммуноглобулинов человека, избыток которых удаляют отмыванием (3) и производят учет результатов в зависимости от используемой метки. Количество АТ в исследуемом материале прямо пропорционально концентрации меченых продуктов реакции.

 

3. Иммунохимические методы на основе диффузии и электрофореза

В процессе иммунодифузии растворённый антиген и растворённое антитело взаимодействуют между собой с образованием нерастворимого комплекса АГ-АТ (преципитат). Детекцию можно проводить либо визуально, либо при помощи специальной измерительной аппаратуры. При этом следует отметить, что здесь очень большое значение имеет точность в соотношении концентраций между антигенами и антителами. Согласно закономерности Гейдельберга-Кенделла (рисунок 4.7), видимая преципитация с образованием крупных комплексов возможна только при определенном (эквивалентном) соотношении концентраций антигена и антител.

А В С

Рисунок 4.7 – Кривая Heidelberger-Kendall

Антитела обычно бивалентны, то есть имеют два участка связывания с соответствующим антигеном. Антигены, в свою очередь, имеют много участков связывания с АТ (то есть мультивалентны). В условиях избытка АТ (зона А), они стремятся занять все участки связывания на молекуле антигена. При этом количество молекул антител, соединяющих между собой в виде ”мостика” две молекулы антигена, является низким, преципитация мало выражена, измерительный сигнал низкий.

В зоне эквивалентности (зона В) в реакционной смеси количество участков связывания для антител в молекулах антигенов сравнимо с количеством мест связывания антигенов в молекулах антител, поэтому перекрёстное связывание АГ-АТ достигает максимума. В результате формируются большие иммунные агрегаты и измерительный сигнал максимальный.

В зоне избытка антигена (зона С) в реакционной смеси каждая молекула антигена стремится к взаимодействию с двумя свободными (не входящими в состав иммунопреципитата) молекулами антител, предотвращая тем самым процесс перекрёстного взаимодействия между ними (избыток антигена как бы «растаскивает» сетку иммунопреципитата на отдельные компоненты).

 

Реакция иммунопреципитации может происходить не только в жидкостях, но и в гелях. Пассивная иммунодифузия антигена и антитела может быть активизированна при помощи различных электрофоретических методик (см. раздел 4.3.2).