Радиоиммунологический анализ

Радиоиммунологический анализ применяется с исследовательскими целями с 1960 г. Характерной чертой радиоиммунологических методов является сочетание специфичности, свойственной реакциям АГ-АТ, с простотой и высокой чувствительностью определения, которые дает применение радиоактивных изотопов, введенных в состав АГ или АТ. Существующие методические варианты постановки РИА очень многообразны (конкурентные тесты, сэндвич-тесты, методы двойных АТ).

Радиоиммунологическое определение состоит из четырех основных этапов: инкубации, разделения, радиометрического исследования и учета результатов. Инкубация осуществляется при различных температурных режимах. Длительность ее зависит от молекулярной массы реагирующих антигенов и температуры, при которой происходит реакция. Для антигенов с малой молекулярной массой (тироксин, трийодтиронин, кортизол) время инкубации составляет от 30 минут до 2 ч; для антигенов с большой молекулярной массой (соматотропин, тиротропин и др.) – 24 ч. Если инкубация проводится при комнатной температуре, этот процесс сокращается, при низкой температуре (4°С) – удлиняется. На втором этапе комплекс «антиген—антитело» отделяется от непрореагировавших компонентов и подвергается радиометрическому исследованию. Для этого используют сцинтилляционные счетчики. Гормоны белковой и пептидной природы, содержащие аминокислоты тирозин и гистидин, обычно метят ¹²⁵I, который обладает достаточно длительным периодом полураспада (60 сут) и низкоэнергетическим гамма-излучением. Антигены, не содержащие указанных аминокислот, обычно метят по тритию, являющемуся источником чистого бета-излучения с очень низкой энергией и длительным периодом полураспада (12 лет).

Один из наиболее простых вариантов применения радиоиммунологических исследований – радиоаллергосорбентный тест (РАСТ), приведен на рисунке 4.10.

 

 

Рисунок 4.10 – Принцип радиоаллергосорбентного теста

Аллерген химически связан с планшетом (нитрат целлюлозы или агарозные шарики). При добавлении сыворотки пациента специфический IgЕ связывается с иммобилизованным аллергеном. Несвязавшиеся ингредиенты удаляются промывкой. Затем добавляется радиоактивно-меченый антииммуноглобулин, который прикрепляется к специфическому IgЕ, уже связавшемуся с аллергеном. Концентрация специфического IgЕ в крови пациента определяется по количеству радиоактивной метки.

В настоящее время радиоиммунологический анализ широко используется для количественного определения гормонов, онкомаркеров, фармацевтических препаратов, иммуноглобулинов, инфекционных антигенов и т.д. с целью диагностики и контроля самых различных патологических состояний (онкология, инфекционные болезни, аллергия, эндокринные нарушения).

 

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на том же принципе, что и радиоиммунный анализ, только вместо радиоактивной метки применяется ферментная. Метод предложен в начале 70-х годов тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с соавт. в США. По превращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции АГ-АТ. Методы ИФА обладают очень высокой чувствительностью, позволяя определять минимальные количества вещества (нанограммы).

Гомогенный вариант ИФА используется для определения низкомолекулярных субстанций (гаптены), например, для детекции лекарственных препаратов (теофиллин фенитоин), наркотических веществ. Диапазон детекции от 10^-4 до 10^-9 моль/л. В основе лежит ингибирование активности фермента (например, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы) при соединении его с гаптеном (активность фермента восстанавливается в результате реакции АГ-АТ) либо, наоборот, потеря активности маркерного фермента в результате реакции АГ-АТ. Активность фермента пересчитывается при помощи калибровочной кривой в концентрацию исследуемого антигена пробы.

В гетерогенных вариантах ИФА АГ или АТ фиксируется на твердой фазе (как правило, пластик), а непрореагировавшие компоненты реакции удаляются многократным отмыванием. Схема постановки гетерогенного ИФА (конкурентные и неконкурентные методы) в целом соответствует приведенным на рисунках 4.5 – 4.6 Отличие заключается в том, что после последнего этапа проводится ферментативная реакция. Учет реакции осуществляется по изменению интенсивности окраски раствора с использованием калибровочной кривой. Наиболее часто применяемые в качестве метки ферменты приведены в таблице 4.1.

Таблица 4.1 - Ферменты-маркеры, наиболее часто используемые в ИФА

Фермент	Субстрат и индикатор реакции (хромоген)	Реагент, останавливающий реакцию	Длина волны для оценки реакции
Пероксидаза	Н2О2 орто-дианизидин (или ортофенилендиамин)	HCl 5 M Na2SO4 2 M	535 нм
2,2–азино-диэтилбензтиазолин-сульфат (АБТС)	NaOH 1 М	405 нм
Щелочная фосфатаза	Пара-нитрофенилфосфат	NaOH 1 М	402 нм
Глюкозооксидаза	Н2О2 (пероксидаза) о-дианизидин или АБТС	Н2SO4 0,5 M	405 нм

В качестве твердой фазы для ИФА применяют такие материалы как полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиакриламид и др. Твердая фаза может быть использована в виде пробирок, планшетов, бусин, шариков, гранул, пленок. Необходимым прибором для ИФА является фотометр (при постановке реакции в планшетах – вертикальный). Воспроизводимость результатов ИФА зависит от ряда факторов, в том числе условий измерения, оптимизации фермент-субстратного взаимодействия, толщины слоя и поглощающих свойств анализируемых растворов. Негомогенность материала планшетов (неконтролируемый фактор) отрицательно влияет на воспроизводимость. Существенное значение имеет также аккуратность отмывки между отдельными этапами анализа. Коэффициент вариации ИФА составляет менее 10%.

Область применения и чувствительность ИФА соответствуют радиоиммунологическим методам исследования, но ИФА по сравнению с РИА обладает рядом преимуществ:

· не используются радиоактивные изотопы;

· стабильность конъюгатов позволяет хранить их в течение длительного времени;

· измерения проводят в оптическом диапазоне;

· имеется возможность полуколичественной оценки результатов (без применения аппаратуры);

· метод легко поддается автоматизации;

· используемые материалы и приборы дешевле, чем для РИА.

Учитывая преимущества ИФА, метод очень широко применяется в клинических лабораториях для определения гормонов, лекарственных средств, онкомаркеров, белков сыворотки (ферритин, фибронектин, гаптоглобин, иммуноглобулины, С-реактивный белок) и др.

Иммуноблотинг

Блотинг – перенос электрофоретически разделенных веществ на иммобилизованные матрицы. Иммуноблотинг дополнительно включает иммунохимический анализ разделенных фракций. Преимуществами методами являются:

· получение на матрице идеальной копии электрофоретического разделения веществ, присутствующих в геле;

· возможность проведения с образцом на матрице различных аналитических процедур (что в гелях невозможно);

· высокая чувствительность и специфичность метода.

Иммуноблотинг используется для анализа белков, ДНК, РНК.

Саузерн блотинг – метод переноса фрагментов ДНК (с агарозы на нитроцеллюлозу под действием капиллярных сил). Далее они гибридизируются с меченой радиоактивным изотопом известной ДНК для проверки комплементарных последовательностей. Если обе нуклеиновые кислоты одинаковы, происходит их гибридизация (образование двойной спирали), радиоактивная метка закрепляется, в противном случае – удаляется.

Норзерн блотинг по принципу аналогичен вышеописанному, но используется для идентификации РНК.

Вестерн блотинг –- метод переноса фрагментов белка (с додецилсульфатполиакриламидных гелей на полосу чистой немодифицированной нитроцеллюлозы) (рисунок 4.11).

Рисунок 4.11 – Схема иммуноблотинга (Вестерн блотинг)

На первом этапе проводится электрофоретическое разделение белков в соответствии с их молекулярными массами методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) с добавлением 2-меркаптоэтанола. В среде с ДСН все белки приобретают отрицательный заряд, а 2-меркаптоэтанол способствует разрыву дисульфидных мостиков. В результате белки теряют свой характерный заряд и форму и разделяются только в соответствии с молекулярными массами. На следующем этапе осуществляют перенос (блотинг) белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану, которую обрабатывают сывороткой больного. При наличии в ней специфических к разделенным антигенам антител происходит реакция АГ-АТ, которая визуализируется путем обработки мечеными антителами против иммуноглобулинов человека.