Электрофорез с последующей иммунофиксацией

Проводят электрофорез (чаще на целлюлозно-ацетатных мембранах), а затем идентифицируют белки с помощью антисывороток. Для этого пластину делят на сегменты, которые затем погружают в антисыворотку. Обработанный сегмент (в нем образуется преципитат) прокрашивают (например, красителем понсо S или нигрозином). Метод удобен для определения белков Бенс-Джонса, парапротеинов в низкой концентрации.

Встречный иммуноэлектрофорез отличается тем, что взаимодействие антигена и антител происходит не вследствие свободной диффузии, а в постоянном электрическом поле, в результате чего и формируются зоны преципитации. Ввиду различного состава белков, они передвигаются в щелочной среде буферного раствора с различной скоростью и в разных направлениях: большинство АГ имеет отрицательный заряд и двигается к аноду, в то время как АТ обычно практически нейтральны и вместе с током жидкости передвигаются в обратном направлении – к катоду. Таким образом, АГ и сыворотка, содержащая специфичные к нему АТ, двигаются в слое геля навстречу друг другу. При контакте АГ и АТ образуются четкие зоны преципитации.Оценка реакции производится качественно в сравнении с контрольным рисунком, в качестве которого используется рисунок зон преципитации, образовавшийся при взаимодействии известных АГ и АТ. Метод используется для диагностики различных инфекционных заболеваний и считается методом второго поколения по сравнению с методами иммунодиффузии (чувствительность ≈ в 10 раз выше, продолжительность реакции меньше – около 3-х часов в сравнении с 24 часами при иммунодиффузии).

В целом следует отметить, что методы иммуноэлектрофореза достаточно трудоемки для выполнения и требуют большого количества дополнительного оборудования (камеры для электрофореза, электроды, камеры для окрашивания и сушки образцов и др.). Учет результатов чаще проводится качественно, но возможна и количественная оценка за счет использования оптических денситометров. Эти приборы позволяют определять оптические характеристики зон преципитации с последующим вычислением концентрации вещества в каждой фракции.

 

Методы микроскопии в клинико-диагностической лаборатории

Микроскоп (от лат. micros – малый и scopein – рассматривать, наблюдать) – прибор, позволяющий получать увеличенное изображение объектов и структур, недоступных глазу человека.

Основу микроскопических методов исследования составляет световая и электронная микроскопия. Световая микроскопия основывается на законах геометрической оптики и волновой теории образования изображения, в качестве освещения используются естественный или искусственные источники света. Электронная микроскопия обеспечивает получение электронно-оптического изображения с помощью потока электронов. Построение изображения основывается на законах геометрической и волновой оптики, а также теории электромагнитных полей. Световые микроскопы обеспечивают увеличение до 2-3 тысяч раз, а электронные микроскопы – в 20000 раз. Однако, несмотря на широкие возможности, электронные микроскопы в основном используются в научно-исследовательских лабораториях.

Основными характеристиками микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность – это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение светового микроскопа – выше 0.2 мкм. Контраст изображения – это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 - 4 %, то его невозможно уловить глазом; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча. Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света – длина волны, яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Общееувеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У наиболее распространенных в КДЛ биологических микроскопов увеличение окуляра равно 7х, 10х, а увеличение объективов – 10х, 20х, 40х и 90х (или 100х). Соответственно, общее увеличение таких микроскопов составляет до 1000 раз. Некоторые современные биологические исследовательские микроскопы имеют увеличение до 2000 раз. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается, напротив, качество изображения ухудшается.

Методы световой микроскопии

Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив. Этот метод микроскопии используется в КДЛ наиболее часто – например, исследование осадка мочи, окрашенных мазков крови и др.

Метод тёмного поля в проходящем свете используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Для работы используются конденсоры специальной конструкции – так называемые конденсоры тёмного поля. Основная особенность темнопольных конденсоров заключается в том, что центральная часть у них затемнена и прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. Объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате (рисунок 4.16).

Рисунок 4.16 – Схема световой микроскопии с темнопольным конденсором (пояснения в тексте)

 

Перед началом работы свет устанавливают и центрируют по светлому полю, затем светлопольный конденсор удаляют и заменяют темнопольным конденсором. Препарат готовят по методу «раздавленной капли», делая его как можно более тонким. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающиеся от окружающей среды показателем преломления.

Темнопольная микроскопия наиболее широко применяется в микробиологии для повышения контраста изображения объекта, например, для изучения живых неокрашенных микроорганизмов (при исследовании подвижности бактерий, которые в живом состоянии не видны в светлом поле) и т.п.

Метод фазового контраста предназначен для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные клетки. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает так называемый «фазовый рельеф»). Не воспринимаемые непосредственно глазом эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, то есть в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из специального конденсора с револьвером диафрагм и центрирующим устройством; объективы заменяют на иммерсионные объективы-апохроматы (рисунок 4.17).

 

Рисунок 4.17 – Схема фазово-контрастной микроскопии

В конденсоре вместо ирисовой диафрагмы размещен кольцевой фильтр, который через конденсорную оптику освещает препарат. Весь пучок света поступает в объектив. Фазовое кольцо объектива выполняет две функции: гасит как серый фильтр сильный прямой свет, поступающий из кольцевой диафрагмы конденсора, и придает этому свету постоянное фазовое смещение. Объекты, содержащиеся в препарате (клетки, их ядра), отклоняют свет из прямого луча на новую траекторию. Этот свет не проходит через фазовое кольцо в объективе и таким образом не ослабляется и не задерживается. Лучи, поступающие с различной задержкой, накладываются друг на друга и взаимно усиливаются или ослабляются. В результате исследуемая клетка становится видимой для глаза. Препарат должен быть максимально тонким, иначе в результате пространственного наложения нескольких структур изображение становится нечетким.

Настройка фазового контраста заключается в следующем:

1. Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph).
2. Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой "0").
3. Настраивают свет.
4. Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат.
5. Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму.

6. Вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный телескоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный телескоп и вновь устанавливают окуляр.

В отличие от метода темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта. Фазово-контрастная микроскопия применяется при исследовании неокрашенных объектов, например, для подсчета тромбоцитов в камере Горяева, выявления микроорганизмов. Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается, и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения цитопатогенного действия и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики – инвертированные микроскопы (см. ниже).

Исследование в поляризованном свете. В этом методе используется линейно поляризованный свет, то есть световые волны, имеющие одинаковое направление колебаний. Такой свет создается поляризаторами, фильтрующими из хаотичных направлений колебаний в естественном свете одно преимущественное направление. Метод предназначен для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы, то есть структуры, которые изменяют скорость распространения поляризованного света в зависимости от его направления по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях – отрицательное двойное лучепреломление. Изменение поляризации при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей позволяет судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов.

Для проведения таких исследований используются специальные поляризационные микроскопы. Поляризация света достигается применением пленчатых поляроидов или призм Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете.

Поляризационная микроскопия используется в гистологических, цитологических, микробиологических исследованиях. Многие биологические объекты являются анизотропными, например, миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, коллагеновые волокна и др. При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные (нативные) препараты.

Исследования в свете люминесценции. Метод основан на наблюдении свечения микроскопических объектов под воздействием сине-фиолетового света или ультрафиолетовых лучей.

Для люминесцентной микроскопии тканей используют первичную и вторичную люминесценцию. Первичной люминесценцией (люминесцентное свечение, возникающее без предварительной обработки препаратов) с достаточной интенсивностью обладают некоторые вещества, входящие в состав клеток и тканей: некоторые витамины, гормоны, белки и др. Принцип первичной люминесценции положен в основу цитохимического изучения содержания различных компонентов клеток (например, белков) с помощью метода люминесценции в УФ-лучах.

Вторичная люминесценция достигается с помощью обработки препаратов флуорохромами. Флуорохромы – красители, не вызывающие сильной окраски объектов в обычном свете, но флуоресцирующие при облучении. Флуорохромы обладают способностью на экстремально короткое время (миллиардные доли секунд) поглощать свет, а затем снова испускать его. Этот испускаемый свет имеет смещение в сторону увеличения длины волны. Например, если поглощается синий свет, то испускается зеленый, а невидимое УФ-излучение преобразуется в видимый свет (так называемое смещение Стокса по фамилии открывателя эффекта). Особенностью флюорохромов является возможность применения в очень малых концентрациях (до нескольких мкг/мл) и способность окрашивать не только фиксированные, но и живые клетки. Кроме того, различные флуорофоры, в зависимости от их химического строения (а иногда и от их окружения), имеют определенные спектры поглощения (а, следовательно, и испускания света), что позволяет использовать их в комбинации для маркировки различных структур. Наибольшее распространение в клинической лабораторной диагностике получили ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат), акридиновый оранжевый, родамин. Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях.

По сравнению с методами обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ: цветное свечение, высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне, возможность исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов, а также различных жизненных процессов в динамике их развития. Для проведения люминесцентной микроскопии используются либо специальные люминесцентные микроскопы (см. ниже), либо приставки к обычным биологическим микроскопам, позволяющие применять их для наблюдения люминесценции микрообъектов.

В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т.д. В микробиологических исследованиях данная методика используется для обнаружения различных возбудителей инфекционных заболеваний в биологическом материале (например, хламидий, микобактерий туберкулеза и др.).