Современные микроскопические приборы

Парк современных микроскопов для медико-биологических исследований включает в себя следующие основные группы:

· биологические микроскопы (микроскопы проходящего света);

· инвертированные биологические микроскопы (инвертированные микроскопы проходящего света);

· люминесцентные микроскопы;

· поляризационные микроскопы проходящего света;

· анализаторы изображения;

· стереоскопические микроскопы.

По степени сложности (и стоимости соответственно) каждая группа делится на:

· учебные (обучающие);

· рутинные;

· рабочие;

· лабораторные;

· исследовательские.

Биологический микроскоп предназначен для наблюдения в проходящем свете в светлом поле окрашенных и неокрашенных мазков крови, препаратов костного мозга, осадков мочи, клеточных концентратов, тканевых биоптатов и т.д.

Основные функциональные части микроскопа:

· механическая

· оптическая

· осветительная система

Основу механической части микроскопа составляет штатив, который включает в себя основание и тубусодержатель. Основание представляет собой блок, на котором крепится весь микроскоп. В простых микроскопах на основание устанавливают осветительные зеркала или накладные осветители. В более сложных моделях осветительная система встроена в основание без или с блоком питания. На тубусодержателе крепятся несколько узлов: для револьверного устройства, предметного столика, крепления различных насадок и т.д. Предметные столики могут быть подвижными и неподвижными. Неподвижные столики применяют в самых простейших моделях микроскопов. При оснащении микроскопов подвижными столиками возможно механическое перемещение или управление от электродвигателя (сканирующий).

Оптическая часть микроскопа обеспечивает основную функцию микроскопа – создание увеличенного изображения объекта с достаточной степенью достоверности по форме, соотношению размеров составляющих элементов и цвету. Основными оптическими элементами микроскопа являются объективы и окуляры. Объективы микроскопа представляют собой оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения в плоскости. Они имеют сложную оптико-механическую конструкцию, которая включает несколько одиночных линз и компонентов, склеенных из 2-х или 3-х линз. Количество линз обусловлено кругом решаемых объективом задач. Чем выше качество изображения, даваемое объективом, тем сложнее его оптическая схема. Общее число линз в сложном объективе может доходить до 14.

Данные о каждом объективе указываются на его корпусе:

1) увеличение («х»-крат, раз): 10х, 40х, 90х; 2) числовая апертура: 0,20; 0,65, пример: 40/0,65 или 40х/0,65 (числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы и характеризует интенсивность света, приходящегося на единицу площади изображения); 3) дополнительная буквенная маркировка (например, МИ/Oil – масляная иммерсия; ВИ/W – водная иммерсия; ГИ/Glyc - глицериновая иммерсия).

Окуляры – оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза наблюдателя. В общем виде окуляры состоят из двух групп линз: глазной – ближайшей к глазу наблюдателя, и полевой – ближайшей к плоскости, в которой объектив строит изображение рассматриваемого объекта. На окуляре указывается увеличение – 7х, 10х и т.д.

Осветительная система микроскопа представляет собой систему линз, диафрагм и зеркал, обеспечивающую равномерное освещение объекта и полное заполнение апертуры объектива, и состоит из двух частей – коллектора и конденсора. Коллектор при встроенной осветительной системе проходящего света расположен вблизи источника света в основании микроскопа и предназначен для увеличения размера светящегося тела. Для обеспечения настройки коллектор может быть выполнен подвижным и перемещаться вдоль оптической оси. Вблизи коллектора располагается полевая диафрагма микроскопа.

Конденсор предназначен для увеличения количества света, поступающего в микроскоп. Конденсор располагается между объектом (предметным столиком) и осветителем (источником света). Чаще всего конденсор выполнен несъемным и неподвижным. В более сложных микроскопах конденсор является съемной частью и при настройке освещения имеет фокусировочное перемещение вдоль оптической оси и центрировочное перемещение, перпендикулярное оптической оси. При конденсоре всегда находится осветительная апертурная ирисовая диафрагма.

Конденсор является одним из основных элементов, обеспечивающих работу микроскопа по различным методам освещения и контрастирования:

1) косое освещение (диафрагмирование от края к центру и смещение осветительной апертурной диафрагмы относительно оптической оси микроскопа);

2) контраст (кольцевое освещение объекта, при этом изображение светового кольца вписывается в фазовое кольцо объектива).

Для расширения функциональных возможностей биологических микроскопов их комплектуют дополнительными принадлежностями, наиболее часто применяемыми из которых являются: накладные осветители, бинокулярная насадка, фазово-контрастное устройство, съемный люминесцентный осветитель, оптические светофильтры, микрофотонасадки.

В практической работе целесообразно учесть следующие рекомендации:

• На качество изображения существенно влияют чистота объектива и препарата. Даже небольшой отпечаток пальца на фронтальной линзе воздушного объектива отрицательно сказывается на контрастности препарата вследствие появления рассеянного света. Аналогичная ситуация складывается и для иммерсионных объективов, загрязненных остатками масла.
• Для объективов, используемых без иммерсионной жидкости, важно, чтобы применяемые покровные стекла имели стандартную толщину (≈ 0,17мм), в противном случае ухудшается качество оптического изображения, особенно при высоких апертурах.
• Нарушения изображения могут возникать при использовании некачественного иммерсионного масла или в случае присутствия в иммерсионном слое пузырьков воздуха. Последнего можно избежать путем правильного нанесения иммерсионной жидкости.
• Фронтальная оптика иммерсионных объективов размещена в подпружиненной гильзе. При прикосновении с предметным стеклом она приподнимается, но на достаточно маленькое расстояние. Поэтому при настройке изображения следует следить, чтобы не произошло раздавливание предметного стекла.

Инвертированные микроскопы проходящего света

Инвертированные микроскопы проходящего света имеют следующие основные конструктивные особенности:

• обратное расположение оптики – объективы находятся под препаратом, а конденсор сверху;
• большой предметный стол для установки различной по габаритам и форме посуды, а при необходимости работы с препаратоводителем – и для крепления различных по габаритам чашек Петри и планшет;
• объективы с большим рабочим расстоянием, так как рассчитаны на работу с «покровным» стеклом (от 0,5 до 2,5 мм, иногда до 5 мм), которым является дно посуды, а также на работу в достаточно большом слое питательной среды в таком же диапазоне;
• конденсоры с таким большим рабочим расстоянием, которое позволяет размещать инструменты и руки над объектом для проведения работ;
• относительно небольшие увеличения по сравнению с обычным микроскопом (при рутинных работах – до 200х, максимум – 630х).

По сравнению с обычным биологическим микроскопом инвертированные микроскопы позволяют исследовать более толстые полупрозрачные образцы (например, культуры клеток) и производить с ними манипуляции прямо под микроскопом.

Инвертированные микроскопы применяются в молекулярной биологии, биотехнологии, иммунологии, причем наиболее широко в исследовательских целях.

Люминесцентный микроскоп

Принцип действия микроскопа основан на использовании явления люминесценции наблюдаемых объектов, возникающей под действием света определенного спектрального состава.

Люминесцентный микроскоп, в отличие от биологического (проходящего света), снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой, применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. Источниками освещения для люминесцентного микроскопа чаще являются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также лампы накаливания – ксеноновые и кварцево-галогенные. Для возбуждения люминесценции при люминесцентной микроскопии обычно используют длинноволновую ультрафиолетовую и сине-фиолетовую область спектра (чаще всего 400-550 нм). Освещение объектов светом, возбуждающим люминесценцию, производится сверху через опак-иллюминатор и объектив.

В практической работе целесообразно учесть следующие рекомендации:

· Лучше всего работать в затененном помещении, так как это позволяет наблюдать даже слабую флуоресценцию. Во время работы не следует выходить в светлые помещения, смотреть на свет лампы.

· Во время перерывов в работе следует перекрыть свет возбуждения специальной задвижкой с фильтром в флуоресцентном иллюминаторе для предотвращения выцветания препарата.

· В работе следует применять только специальные нефлюоресцирующие иммерсионные среды. В противном случае фон становится светлее и контрастность снижается.

· При подготовке препарата к микроскопированию следует принять меры к удалению несвязавшихся флуорофоров, так как их излишек осветляет фон и делает изображение элементов в препарате менее контрастным.

 

Стереоскопический микроскоп

Стереоскопический микроскоп дает прямое и объемное изображение рассматриваемого предмета как в проходящем, так и в отраженном свете. Как известно, человек обладает стереоскопическим зрением, то есть видит предметы объемными при наблюдении их двумя глазами. Стереоскопические микроскопы способны усиливать стереоскопический эффект невооруженного глаза. Оптическая система микроскопа обеспечивает наблюдение объекта под разными углами. Стереоскопические микроскопы применяются в лаборатории для просмотра гелей и пленок, например, для оценки результатов иммунопреципитации в агаре.

 

Уход за микроскопом

Срок службы микроскопа рассчитан приблизительно на 15 лет с учетом естественного старения. Для длительного сохранения микроскопа в рабочем состоянии необходимо выполнять следующие правила эксплуатации и ухода:

· В нерабочее время микроскоп убирают в футляр или, еще лучше, оставляя на рабочем столе, накрывают специальным чехлом, нижний край которого плотно, без щелей соприкасается с поверхностью стола.

· Удаление пыли с микроскопа производят мягкой чистой кистью, затем протирают сухой, мягкой, совершенно чистой салфеткой.

· Жидкости, попадающие на микроскоп во время работы, тщательно удаляют (кедровое масло и канадский бальзам смываются бензином, наркозным эфиром или ксилолом).

· Особое внимание следует обращать на чистоту оптических частей микроскопа, особенно объективов. Нельзя прикасаться к поверхностям линз пальцами, так как это загрязняет их жиром и потом. Для чистки внешних поверхностей линз объективов используют мягкую тряпочку, смоченную чистым спиртом (можно использовать также бензин, наркозный эфир или ксилол). Особое внимание следует обратить на очистку иммерсионных объективов после использования. Масло стирают сухой мягкой тряпочкой, при необходимости объективы протирают чистым спиртом. Развинчивать и разбирать объектив нельзя во избежание его порчи.

Сухая химия

Сухая химия («dry сhemistry») подразумевает анализ биологических жидкостей с помощью технологий использования сухих реагентов на твердофазных носителях. После нанесения исследуемой жидкости на тест-системы происходит активация реагентов и химическая реакция (как в пробирке). Учет результатов может быть качественным, полуколичественным и количественным.

Среди простейших диагностических тестов на твердофазном носителе следует назвать экспресс-тесты в виде моно- (на один компонент) и политестов (на несколько компонентов) для исследования мочи (рН, кетоны, глюкоза, белок, билирубин, уробилиноген, эритроциты, гемоглобин, нитриты, удельный вес) и некоторых компонентов в сыворотке крови (например, мочевина, глюкоза, псевдо-холинэстераза). Оценка результатов производится визуально по цветной шкале и позволяет проводить полуколичественные определения.

Количественные методы «сухой химии» связаны с использованием измерительных приборов. Наиболее часто они основаны на принципах отражательной фотометрии, флюоресцентной спектроскопии, кондуктометрии.

Разработка систем “сухой химии” проводится по двум основным направлениям: с использованием многослойных пленок (слайдов) и с применением импрегнированных волокон.

Аналитические слайды состоят из нескольких слоев, каждый из которых выполняет свою функцию:

1. распределительный слой представляет собой полимер капиллярной структуры со свободным объемом 80%. Он обеспечивает быстрое и равномерное распространение анализируемой жидкости в более глубокие слои. При спектрофотометрическом определении этот слой служит отражающей поверхностью. Свет определенной длины волны проникает через прозрачное основание пленки, отражается от нижней поверхности распределительного слоя, улавливается фотодетектором и измеряется.

2. буферный слой содержит компоненты буферных смесей для поддержания оптимальной для химической реакции рН.

3. реакционный слой (каталитический). В этом слое происходит химическая реакция.

4. разделительный слой. Если продукты химических превращений мешают определению исследуемого вещества, их действие нивелируется физическими или химическими способами.

5. проявительный слой содержит красители или специальные реагенты для образования окрашенных продуктов реакции, которые могут быть определены количественно.

Технологии, основанные на использовании слайдов, впервые были предложены в лабораториях фирмы Коdak. В настоящее время микрослайдовые технологии этой фирмы широко используются в различных областях медицины (военной, экстремальной и.т.д.).

В тестах второго типа в качестве носителя используют импрегнированные волокна из чистой альфа-целлюлозы. Бумажные матрицы имеют стандартную плотность волокон и определенную толщину. Реактивы абсорбируются на носителе путем погружения в соответствующие растворы с последующим высушиванием. Ведущим производителем таких систем является фирма «Roche Diagnostics». Эти системы «сухой химии» позволяют определить количественно различные компоненты биожидкостей: ферменты, субстраты (глюкоза, холестерин, белок, билирубин и др.).

Системы “сухой химии” являются удобным диагностическим средством для тех ситуаций, когда необходимо получение быстрых и надежных результатов (скорая помощь; у постели больного; полевые условия, профосмотры, скрининговые обследования, амбулаторные приемы).

К их достоинствам относятся:

· быстрота и простота анализа;

· малый объем биопробы жидкости, необходимый для анализа;

· возможность получения качественных и полуколичественных результатов без использования оборудования и высококвалифицированного персонала;

· возможность проведения анализа в цельной крови (во многих случаях);

· простота обслуживания приборов для количественного определения.

Недостатками систем «сухой химии» являются:

· довольно высокая стоимость анализа;

· зависимость выбора метода от производителя;

· возможность интерференции лекарств.

Основная часть стоимости приходится на дорогостоящую технологию, так как каждая партия требует калибровки, и специфическая информация для каждого носителя реактивов должна быть нанесена на магнитный код.