Референтные интервалы лабораторных показателей

Под «нормой» обычно понимают характеристики, соответствующие состоянию здоровья. Понятие здоровья имеет много взаимно увязанных определений, как в медицине, так и в философии, в зависимости от применяемого критерия оценки. По определению А. Д. Адо «Здоровье – это форма жизнедеятельности, обеспечивающая наиболее совершенную деятельность и адекватные условия существования». Всемирная организация здравоохранения определяет здоровье как «Состояние полного физического, духовного и социального благополучия, а не только отсутствие болезней и физических дефектов». Однако, несмотря на разнообразие факторов, определяющих состояние здоровья, одним из ключевых его критериев является соответствие физиологических параметров организма нормальным значениям. Поэтому понятие «норма» является весьма близким к понятию «здоровье» и успешно используется в клинической медицине для оценки состояния здоровья.

Следует обратить внимание, что медицинская норма является не фиксированным типичным стандартом, а скорее конкретным переменчивым оптимумом. В зависимости от целого ряда параметров, как внутренних, так и внешних, организм обладает способностью варьировать признак в определенных пределах, «приспосабливаться», что позволяет ему выживать в постоянно меняющихся условиях жизни. Параметры нормальных значений колеблются в зависимости от экологических условий, особенностей физиологических процессов в организме человека, возраста, пола, в соответствии с циркадными ритмами, физической активностью, характером питания и рядом других факторов. То есть каждый параметр имеет свои нормальные переменные пределы, которые называют референтным интервалом. Термин «референтные значения» или «референтный интервал» в современной литературе сменил ранее употребляемый термин «норма».

Установление референтных интервалов колебаний для каждого параметра внутренней среды организма имеет чрезвычайно важное значение для обеспечения клинической надежности лабораторной информации. В то же время, определение референтных интервалов представляет значительные организационные и практические трудности, в связи с необходимостью контролируемого обследования больших групп практически здоровых лиц разного возраста. Наиболее часто используются два основных подхода. Первый из них предполагает динамическое обследование людей в состоянии полного клинического здоровья, отобранных в соответствии с жесткими критериями, учитывающими влияние различных физиологических состояний, отклоняющих результаты лабораторных исследований в сторону повышения или понижения. Его недостатками является возможность реализации лишь у очень ограниченного круга пациентов, высокая стоимость и сложность проведения. Второй подход является более доступным и предполагает массовое обследование неорганизованного контингента практически здоровых лиц с последующей статистической обработкой полученных показателей. Осуществляется сбор всех результатов в памяти больничного компьютера, селекция результатов на основе отбрасывания тех из них, которые получены у пациентов с патологией, способной повлиять на показатели соответствующего теста; а затем группировка отобранных результатов по половым и возрастным группам и статистическая обработка результатов в каждой группе. Такой подход реализуется значительно легче и поэтому используется наиболее широко.

Совокупность результатов, полученных для популяций здоровых людей, может быть описана статистическими методами в следующем виде:

1. Симметричное распределение, соответствующее нормальному распределению Гаусса. Гауссово распределение означает, что в обследуемой однородной группе здоровых людей статистическая обработка результатов лабораторного исследования определенного параметра биоматериала позволяет вычислить среднюю величину и стандартное отклонение, причем в интервале M±2SD (средняя арифметическая ± 2 среднеквадратичных отклонения) окажутся примерно 95% показателей, полученных в обследуемой группе, а 5% показателей здоровых людей окажутся вне этого интервала (рисунок). Этой математической закономерности подчиняются результаты небольшой части показателей химического и клеточного состава крови.

 

Рисунок 3.4 – Гистограмма распределения результатов определения количества Т-хелперов при обследовании здоровых лиц

Отчетливо видно, что среднее арифметическое значение (М) совпадает с медианой (центр, от которого половина значений будет меньше, а половина больше медианы). В интервале M±2SD (средняя арифметическая ± 2 среднеквадратичных отклонения) сосредоточены примерно 95% наблюдений.

 

2. Несимметричное распределение. Этот тип распределения называется биноминальным и требует применения непараметрических методов статистической обработки. Пример несимметричного распределения приведен на рисунке 3.5.

 

 

Рисунок 3.5 – Гистограмма распределения результатов определения количества лейкоцитов (х10⁹/л) у здоровых лиц

Кривая линия представляет ожидаемое нормальное распределение.

Такой закономерности подчиняется большинство лабораторных параметров. Для определения интервала нормы в этих случаях наиболее часто применяют метод перцентильных границ. Весь диапазон значений разбивают на 4 интервала, получая, соответственно, 25%, 50%, 75% квантили. Внутри интерквартильного интервала (25% - 75%) лежат 50% наиболее типичных (близких к центральному) значений.

Выбор референтного интервала должен производиться, исходя из клинических соображений. Если выбрать в качестве референтного интервала интерквартильный размах (25-75%), диагностическая чувствительность теста становится выше в ущерб специфичности, так как часть результатов, попадающих в так называемую «серую зону», будут расцениваться как положительные (измененные), тогда как на самом деле могут быть и ложно положительными (рисунок 3.6). При выборе в качестве диапазона нормы границы 5-95% диагностическая специфичность повышается, то есть выход значений лабораторного параметра за указанные пределы будет более точно свидетельствовать о патологии, что позволяет произвести надежную дискриминацию показателей здорового и больного человека.

 

Рисунок 3.6 - Варианты выбора диапазона нормальных значений показателя

 

Следует помнить, что референтные колебания должны быть установлены для каждого параметра внутренней среды организма. Учитывая обилие факторов, влияющих на результат лабораторного анализа, оптимальным является установление каждой лабораторией своих референтных интервалов с учетом всех требований, предъявляемых к качеству лабораторного анализа. Это имеет существенное значение для всей проблемы надежности лабораторной информации, так как именно сравнение каждого показателя с референтным интервалом служит основанием для принятия диагностических и лечебных решений.

В клинической лабораторной диагностике используется также такое понятие как «индивидуальная норма», когда производится сопоставление результатов пациента с его же собственными параметрами, полученными в период полного здоровья. Индивидуальная норма признается наиболее удобным ориентиром для оценки состояния здоровья у каждого конкретного человека. Однако при отсутствии систематического диспансерного наблюдения за пациентом такими индивидуальными интервалами удается воспользоваться лишь в отношении очень ограниченного круга пациентов.

 

 

Часть 4

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

 

4.1. Оптические методы анализа

Для измерения продуктов биохимической реакции в клинической лабораторной диагностике чаще всего используются оптические измерительные приборы. Оптический количественный анализ основывается на регистрации изменений, происходящих с лучом света при прохождении его через исследуемый раствор.

Оптические методы количественного анализа подразделяются следующим образом:

1. рефрактометрия;

2. поляриметрия;

3. фотометрия:

а) абсорбционная:

• спектрофотометрия

• нефелометрия (собственно нефелометрия и турбидиметрия)

• атомно-абсорбционная фотометрия

б) эмиссионная:

• флюориметрия

• пламенная фотометрия

• атомно-эмиссионный спектральный анализ.

Рефрактометрия базируется на измерении показателя преломления света при прохождении его через оптически неоднородные среды. Ранее метод рефрактометрии применялся в основном для определения содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови. Поскольку преломляющая способность сыворотки зависит от уровня не только белков, но и небелковых компонентов, рефрактометрический анализ давал ложно завышенные результаты, и в настоящее время для данного анализа не применяется.

В основе поляриметрии лежит свойство прозрачных веществ вращать плоскость поляризованного луча света. Известно, что естественный, неполяризованный луч представляет собой совокупность волн, колебательные движения которых равномерно распределены вдоль множества плоскостей, проходящих через линию распространения луча. Если луч сложного (белого) света пропустить через пластинку поляроида или призму николя (кальцит), то каждая волна этого пучка разложится на составляющие, направленные по взаимно перпендикулярным осям поляроида. Так как поляризующий материал обладает способностью поглощать одну из этих составляющих, электромагнитные колебания в выходящем пучке света происходят только в одной плоскости, в связи с чем такой луч света называют плоскополяризованным. Если на его пути поместить второй поляроид, то через него подобным же образом пройдет только та составляющая луча, плоскость колебаний которой будет параллельна оси поляроида. Поскольку же в пучке поляризованного света колебания совершаются только в одном направлении, при повороте второго поляроида (анализатора) на 90 градусов мощность светового пучка падает до нуля. Поляризованный луч света будет проходить через призмы николя только в том случае, если их оси находятся в одной плоскости. Регистрации результатов производится по изменению плоскости поляризованного луча света. В современных КДЛ данный метод не нашел широкого применения.

Фотометрия – измерение интенсивности света, прошедшего через раствор. В основе всех методов фотометрии лежит закон Бугера-Ламберта-Бера, независимо от того, в какой области спектра (видимой, ультрафиолетовой или инфракрасной) выполняется измерение, а также от того, каким способом измеряется интенсивность светового потока и как проводится расчет. Закон описывает взаимозависимость между интенсивностью падающего на раствор монохроматического света и интенсивностью светового потока, выходящего из раствора:

Е = logIo/It = Сlε

Е – экстинция раствора (оптическая плотность);

Io – интенсивность падающего на раствор света;

It – интенсивность светового потока, выходящего из раствора;

С – концентрация вещества в растворе;

l – длина оптического пути (толщина кюветы фотометра);

ε – молярный показатель поглощения.

В упрощенном виде уравнение можно представить таким образом:

Е = К х С, где К – константа, являющаяся произведением коэффициента поглощения на толщину рабочего слоя; С – концентрация вещества в растворе. То есть оптическая плотность раствора при прочих равных условиях прямо пропорциональна концентрации вещества.

Следует учитывать, что эта зависимость сохраняется только при условии монохроматического света и физической однородности раствора. Она подтверждается экспериментальным путем для данного прибора и данных условий измерений и воплощается в калибровочных графиках, где на оси абсцисс откладывают известные концентрации раствора, а на оси ординат – значения экстинции. Соответствие закону Ламберта-Бера, то есть линейная зависимость, имеет место лишь на определенном участке калибровочного графика (обычно в середине, при не слишком высокой и не слишком низкой концентрации вещества). На основании калибровочного графика можно рассчитывать коэффициент пересчета (см. ниже).

Фотометрия может выполняться в различных вариантах.

Абсорбционная фотометрия – метод анализа, основанный на измерении степени ослабления монохроматического светового потока в результате избирательного поглощения света растворенным веществом. Является самым широко используемым в клинической лабораторной диагностике методом измерения результатов реакции.

Основными методами абсорбционной фотометрии являются спектрофотометрия и нефелометрия.

Спектрофотометрия (в общем смысле колориметрия) – измерение интенсивности окраски раствора анализируемого вещества относительно интенсивности окраски эталонного раствора. В работе может использоваться любая область спектра, но наиболее широко применяется ультрафиолетовый и видимый диапазон. Измерения осуществляются с помощью специальных приборов – фотометров и спектрофотометров.

Основными элементами фотометра являются источник света, монохроматическое устройство, кюветное отделение и фотоприемник (рисунок 4.1).

Рисунок 4.1 – Общая схема устройства фотометра (пояснения в тексте)

Источник света зависит от рабочего диапазона. В качестве источника ультрафиолетового света (длина волны менее 400 нм) обычно используется дейтериевая лампа, а в качестве источника видимого излучения – лампа накаливания. В последнее время все более широкое применение находят светодиоды – полупроводниковые устройства, излучающие монохроматический свет. Основное их преимущество – отсутствие нагревания во время работы и необходимости применения монохроматоров.

Монохроматоры служат для получения монохроматического света. В фотометрах нужные спектральные диапазоны выделяются при помощи светофильтров. Поэтому число участков спектра, в котором может проводиться измерение, равно числу светофильтров (чаще всего используются цветные стекла). В спектрофотометре участки света выделяются с помощью призм или дифракционных решеток, поэтому можно установить любую длину волны в заданном диапазоне. Дифракционная решетка представляет собой зеркало, на поверхности которого нанесены параллельные штрихи (несколько сот штрихов на миллиметр), что обеспечивает дифракцию, поэтому под определенным углом отражается только свет соответствующей длины волны. Обычно спектрофотометры – это приборы более высокого класса, в них можно выделить более узкий (монохроматический) участок спектра.

Кюветы и кюветные отделения. В кюветных отделениях для проведения измерений устанавливаются кюветы с фотометрируемым раствором. Их размещают в специальных кюветодержателях.

Современные фотометры и спектрофотометры имеют термостатированные кюветные отделения. Это позволяет проводить измерения при фиксированной температуре, что особенно важно для кинетического определения активности ферментов.

Точность фотометрии значительно возрастает, если нет необходимости каждый раз вынимать кювету для заполнения новой порцией раствора. Для этого существуют различные конструкции проточных кювет. Необходимо, однако, помнить, что количество раствора должно быть достаточным, чтобы промыть кювету.

В качестве приемника излучения для видимой и ультрафиолетовой области используются специальные фотоэлементы, для инфракрасной области – фотосопротивления. Воспринимаемый ими световой поток вызывает пропорциональный его интенсивности фототок, который измеряется специальными приборами.

Большинство фотометрических приборов устроено так, что они непосредственно указывают величину оптической плотности. Как правило, имеется возможность отсчитывать результаты и по другой шкале – в процентах поглощенного или прошедшего света относительно фоновых величин. Например, на фотоэлектроколориметре (ФЭК) шкала оптических плотностей нанесена красной краской, а шкала процентов пропускания – черной. Если оптическая плотность 1, это значит, что через раствор прошло только 10% света, а остальные 90% поглотились в нем. Для большинства приборов высокого класса это предельная величина, выше которой уже трудно получить надежные результаты.

Современные лаборатории оснащены фотометрами различной степени сложности. Наиболее широко распространены фотоэлектроколориметры и фотометры Solar. Они являются базовыми приборами в клинико-диагностических лабораториях небольшой мощности и позволяют обеспечить выполнение биохимических и коагулологических исследований. Полуавтоматические фотометры оснащаются микропроцессорами, управляющими процессами фотометрического измерения, термостатирования, расчета результатов, что значительно ускоряет и облегчает работу.

Широкое применение, особенно для иммунохимических методов анализа, получили многоканальные фотометры, работающие по вертикальной схеме. Луч света идет снизу вверх или сверху вниз. Вместо измерительных кювет в этих случаях используются прозрачные пластмассовые планшеты на 96 лунок (микрокювет).

Нефелометрия – метод анализа, связанный с оценкой степени мутности исследуемого раствора. Мутность возникает в результате взвешивания в растворителе мельчайших твердых частиц вещества, которые рассеивают лучи света, проходящего через раствор. Интенсивность рассеивания света возрастает с увеличением размера и числа рассеивающих частиц. Причем такая закономерность в сильно разбавленных растворах находится в соответствии с основным законом фотометрии, что позволяет определять концентрацию вещества по степени мутности образуемых им растворов.

В зависимости от способа регистрации луча света, проходящего через мутный раствор, нефелометрию делят на 2 вида: а) собственно нефелометрия; б) турбидиметрия.

Собственно нефелометрия предусматривает, что источник света и приемник света расположены на взаимно-перпендикулярных осях (рисунок 4.2).

 

Рисунок 4.2 – Общая схема нефелометрического анализа (пояснения в тексте)

 

При этом измеряется интенсивность светового потока, возникшего вследствие рассеяния падающего на взвесь света. Для проведения таких измерений существуют специальные приборы – нефелометры. Метод позволяет определять небольшие концентрации взвешенных частиц в слабо мутных растворах. При высокой мутности растворов возникает значительная погрешность измерения. Основным недостатком метода является влияние размеров частиц на интенсивность рассеянного света – при увеличении размеров частиц в анализируемой взвеси зависимость интенсивности анализируемого излучения от длины волны ослабляется.

Турбидиметрия предусматривает, что источник света и приемник света находятся на одной оси (схема аналогична рис. 4.1). Регистрируется световой поток, прошедший через пробу, содержащую частицы (мутный раствор), и ослабленный преимущественно вследствие поглощения и в меньшей степени рассеяния. Метод обычно используется для исследования более оптически плотных растворов (в сравнении с нефелометрией). Турбидиметрия очень широко используется в клинической биохимии. Практически все нефелометрические методы в клинике относятся к турбидиметрии (тимоловая проба, определение серомукоидов, бета-липопротеидов и др.)

Атомно-абсорбционная фотометрия – метод определениясостава вещества в газовом или плазменном состоянии по интенсивности спектрального поглощения света атомами и молекулами анализируемого вещества. В основу его положено известное физическое явление, заключающееся в том, что, если атомное облако облучать светом, то происходит абсорбция этого излучения на частотах, характерных для данного вещества. Причем эта абсорбция в значительной степени подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера. Поэтому измеряя интенсивность и спектр светового потока, прошедшего через атомный пар, а не жидкость, как при обычной фотометрии, можно измерить концентрацию интересующего элемента в жидкости, веществе или газе.

Атомно-абсорбционная спектрофотометрия позволяет обеспечить высокую чувствительность, проводить анализ микроколичеств вещества в жидком, газообразном и твердом состояниях. Недостаток метода – высокая стоимость аппаратуры, ее громоздкость, сложности с эксплуатацией. Поэтому атомно-абсорбционные анализаторы используются в медицине, в основном, при проведении научных исследований.

Эмиссионная фотометрия – это метод анализа, основанный на измерении энергии, излучаемой веществом при переходе из энергетически возбужденного состояния в невозбужденное. Энергетическое возбуждение (метастабильное состояние) вещества может быть достигнуто с помощью различных воздействий:

· при облучении интенсивным световым потоком из внешнего источника при комнатной температуре (флюориметрия)

· в результате химической реакции (хемилюминесценция)

· за счет кинетической энергии теплового движения при высокой температуре пламени (пламенная фотометрия).

Флуориметрия выполняется на специальных аппаратах – флуориметрах, которые производят измерение интенсивности флуоресценции (рисунок 4.3).

 

Рисунок 4.3 - Схема устройства флюориметра

1) источник света возбуждения; 2) монохроматор (светофильтр) света возбуждения; 3) кювета с исследуемым раствором; 4) монохроматор света флуоресценции; 5) детектор; 6) измерительный прибор.

Для возбуждения исследуемого вещества чаще всего используется жесткое коротковолновое облучение (ультрафиолетовые лучи). В ряде методик в аналитическую систему специально добавляются флуоресцирующие вещества – флуорохромы. Из флуоресцирующих веществ в клинической лабораторной диагностике наиболее часто используются карбоциклические органические красители (акридиновый оранжевый, флуоресцеинизотиоцианат – ФИТЦ, пропидиум иодид, этидиум бромид и др.), а также редкоземельные металлы, относящиеся к группе лантанидов. Спектры абсорбции (а, следовательно, и возбуждения флуоресценции) большинства флуоресцирующих веществ лежат в области 300-550 нм. Это позволяет использовать в качестве источников света яркие лампы с широким спектром (ксеноновую, кварцевую или галогеновую).

По чувствительности флуориметрия намного выше колориметрических методов (в 100-1000 раз). Однако именно с высокой чувствительностью связаны недостатки метода – прежде всего, необходимость предварительной очистки исследуемого раствора от примесей, которые вносят фоновые искажения. Поэтому в клинических лабораториях данный метод используют не слишком широко (например, для определения катехоламинов – адреналина, норадреналина, диоксифенилаланина).

Хемилюминесценция основана на измерении энергии молекул, перешедших в возбужденное состояние в результате химической реакции. Этот принцип широко используется в иммунохимических исследованиях для детекции ферментных меток. Она значительно чувствительнее и удобнее колориметрической или флуоресцентной детекции. Основными хемилюминесцентными метками служат сульфонамиды и эфиры акридина, а для инициации их свечения используют смесь перекиси водорода и гидроокиси натрия (окислители).

Пламенная фотометрия использует в качестве энергетического агента, вызывающего состояние возбуждения исследуемого вещества, пламя газовой горелки. Ионы металлов окрашивают пламя в различный цвет, в соответствии с характерными для них спектрами испускания. Для выделения излучения отдельных ионов применяют специальные светофильтры (рисунок 4.4).

В клинических лабораториях пламенную фотометрию применяют в основном для определения концентрации ионов калия и натрия, так как для возбуждения этих ионов достаточно энергии низкотемпературного пламени сгорания метана в воздухе. Пламенная фотометрия является высоко чувствительным методом исследования, однако его широкое применение значительно ограничивается необходимостью газового оборудования. Поэтому в современной клинической лаборатории эти методы заменяют на ионоселективные и потенциометрические (см. раздел 2.7.1).

Рисунок 4.4 – Схема пламенной фотометрии

1) поток воздуха от компрессора; 2) распылитель; 3) образец; 4) горелка; 5) монохроматор; 6) измерительный прибор.

Атомно-эмиссионный спектральный анализ позволяет определять отдельные элементы в биологическом материале при возбуждении атомной флуоресценции с помощью соответствующего источника. После переведения пробы в атомарное состояние излучение от внешнего источника поглощается атомами исследуемого вещества, которые переходят в возбужденное состояние, а часть из них начинает флуоресцировать. Интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации исследуемых компонентов пробы. В клинико-диагностических лабораториях метод практически не используется в связи со сложностью исследований и дороговизной оборудования.