Одиниці активності ферментів. Визначення ферментативної активності.

Ферменти є речовинами білкової природи, тому в суміші з іншими білками визначити їхню кількість неможливо. Наявність певного ферменту в препараті може бути встановлена за результатами тієї реакції, яку він каталізує. Тобто, за кількістю утворених продуктів реакції або за зменшенням кількості вихідного субстрату. В кількісних одиницях активність ферментів визначається за початковою швидкістю ферментативної реакції. Однак, ця величина залежить від багатьох факторів (температура, концентрація субстрату, рН). Тому у 1961 році Міжнародним біохімічним союзом прийняті правила визначення активності ферментів і вираження її в одиницях активності.

За стандартну одиницю ферментативної активності приймається кількість ферменту, яка каталізує перетворення одного мікромоля субстрату за одну хвилину при заданих регламентованих умовах (температура, рН, концентрація субстрату та ін.), або, якщо субстрат є високомолекулярною речовиною, перетворення 1 мікроеквівалента задіяних в реакції зв’язків.

Рекомендовано визначати активність ферменту за температури 30°с, високій концентрації субстрату та оптимальному для даного ферменту рН.

Активність ферментних препаратів. Вміст ферменту в препараті виражають у стандартних одиницях активності ферменту на 1мл ферментного розчину або 1г препарату.

Питома активність ферментних препаратів – це величина, яка показує співвідношення між активним і загальним білком в препараті. Це кількість одиниць активності ферменту, що припадає на 1 мг білка. Ферментативна активність визначається за стандартним методом для даного ферменту, а кількість білка визначається за методом Лоурі.

У технології ферментних препаратів використовують також поняття активність умовного препарату. Ця величина необхідна для загальної оцінки роботи підприємства. Для її визначення вважають, що підприємство виготовляє товарну продукцію у вигляді стандартного препарату з точно визначеною активністю. Для перерахунку виробленої продукції на умовні тонни можна скористатися формулою:

Q_умов =Q_тов *A_факт /A_умов

 

Існують такі методи визначення активності ферментів: фізичні, хімічні, фізико-хімічні.

Найбільш розповсюджені фізико-хімічні методи, до яких належать: спектрофотометричні, потенціометричні, полярографічні.

Спектрофотометричні методи базуються на поглинанні світла в певних ділянках спектру сполуками, які є активними групами ферментів, субстратами або продуктами реакції. Положення максимального поглинання при певній довжині хвилі визначається наявністю в матеріалі, що досліджується, певних груп. Для визначення спектрів використовують спектрофотометри або фотометричні абсорбціометри.

Флуоресцентні. Ферменти мають здатність до сильної флюоресценції: НАД і НАДФ у відновленому стані мають сильну флюоресценцію і не мають її в окисленому стані. Спектрофлюоресценцію використовують для вивчення кінетики і механізму дії нікотинамідних та флавінових ферментів.

Колориметричні або фотометричні методи базуються на вимірюванні за допомогою фотоелектричного калориметра забарвленого продукту, який утворюється під час ферментативної реакції. Найбільш перспективними методами вважають ті, що дозволяють спостерігати процес зміни забарвлення в динаміці.

Манометричні – використовуються при визначенні активності ферментів, якщо в реакції, що досліджується, один з компонентів міститься в газоподібному стані (окислення, декарбоксилювання). Ці реакції супроводжуються поглинанням або виділенням кисню та вуглекислоти.

Джерела отримання ферментних препаратів.

Ферменти присутні в усіх живих організмах, але для виділення необхідного ферменту використовують ті природні об’єкти, у яких вміст його становить не менше 1%.

Виділяють такі основні джерела одержання ферментів: рослини, органи та тканини тварин, мікроорганізми.

Рослини як джерело ферментів. В тропічних і субтропічних країнах в якості джерела ферментів протеолітичної дії використовують динне дерево (папаїн), листя інжиру (фіцин), сік зеленої маси ананасу (бромелаїн).

В нашій країні рослинним джерелом ферментів може бути пророщене зерно різних злаків (солод). Солод є джерелом ферментів амілолітичної дії. Він може бути використаний безпосередньо як технічний ферментний препарат, або бути сировиною для отримання очищених ферментів.

Органи та тканини тварин як джерело ферментів. Для отримання ферментів використовують органи травлення великої рогатої худоби, свиней: підшлункову залозу, оболонку тонких кишок, шлунків, сечовик і т.д. Підшлункова залоза містить велику кількість ферментів – хімотрипсин, колагеназу, еластазу, трипсин, амілазу, ліпазу. Із сичугів молочних телят одержують ренін.

Мікроорганізми як джерело ферментів. В спеціально створених умовах мікроорганізми здатні утворювати велику кількість різноманітних ферментів. У виробництві ферментних препаратів використовують як мікроскопічні гриби, так і бактерії, і дріжджі. Мікроорганізми можуть синтезувати одночасно цілий комплекс ферментів або один фермент у великій кількості.

Мікроорганізми для синтезу ферментів використовують, як правило, відходи інших виробництв, виробництво ферментів на основі мікроорганізмів не є сезонним, ціна мікробних ферментних препаратів невисока в порівнянні з іншими джерелами ферментних препаратів.

До мікроорганізмів-продуцентів є певні вимоги:

1. Висока активність штамів по цільовому продукту;

2. Фагостійкість і загальна стійкість щодо спонтанної дисоціації;

3. Стійкість штаму до температури, рН, несприятливих умов;

4. Відсутність токсичних речовин, як побічних продуктів культивування.

Українськими вченими розроблена значна кількість технологій отримання ферментних препаратів на основі мікроорганізмів. Штами, що є продуцентами ферментів, зберігаються в Українській колекції мікроорганізмів.

 

Таблиця 10.1

Штами-продуценти, що зберігаються в Українській колекції мікроорганізмів

Утворення:	Назва таксону і номер штаму
L-аспарагінази   α-галактозидази     глюкозоізомерази   каталази     кератинази   колагенази   рестриктази Bli 491   уреази   фібринолітичних ферментів	Erwinia carotovora B-1148   Cladosporium cladosporioides F-16038 Penicillium canescens F-16073   Streptomyces chromogenes Ac-2024 Streptomyces cyanogenus Ac-2062 Streptomyces fulvostreptomycini Ac-2079 Streptomyces griseoalbus Ac-2083 Streptomyces griseorectus Ac-2084 Streptomyces robeus Ac-2003 Streptomyces sporoclivosus Ac-2080   Penicillium canescens F-6601 Penicillium verruculosum F-4962   Streptomyces griseus Ac-2040   Streptomyces halstedii Ac-2131   Bacillus licheniformis B-5532   Bacillus pasteurii B-5890   Streptomyces griseus Ac-2040 Streptomyces ignobilis Ac-2086 Streptomyces viridogenes Ac-2116

 

Продовження таблиці 10.1

β-фруктофуранозідази     цитологічних ферментів     ендонуклеази

Fusarium avenaceum F-9038 Penicillium expansum F-50383 Penicillium restrictum F-6782   Streptomyces coralus Ac-2077 Streptomyces globosus Ac-2120 Streptomyces halstedii Ac-2121 Streptomyces intermedius Ac-2115 Streptomyces lincolnensis Ac-2105 Streptomyces recifensis Ac-2113 Streptomyces toxytricini Ac-2078 Streptomyces violaceoruber Ac-2028   Bacillus cereus B-5650 Bacillus cereus B-5672 Bacillus subtilis B-5138

 

Питання для самоконтролю:

1. Основні етапи розвитку ензимології.

2. Які основні властивості ферментів?

3. Охарактеризуйте основні джерела отримання ферментних препаратів.

4. Класифікація і номенклатура ферментних препаратів.

5. Опишіть основні принципи і методи визначення ферментів.

6. Дайте визначення поняття «стандартна одиниця ферментативної активності».

7. Яким вимогам мають відповідати мікроорганізми-продуценти ферментних препаратів?

8. Які переваги має отримання ферментних препаратів мікробним синтезом?

9. Якою величиною характеризується ступінь очищення ферментного препарату?

10. Які Вам відомі мікроорганізми-продуценти ферментів?

ВИКОРИСТАННЯ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ