Препарати ферментів підшлункової залози

Із підшлункової залози можна одержати багато різноманітних ферментів - трипсин, хімотрипсин, рибонуклеазу, дезоксирибонуклеазу, панкреатопептидазу, колагеназу і комплексний препарат панкреатин.

Панкреатин. Препарат містить ферменти підшлункової залози, головним чином трипсин, амілазу та в незначній кількості ліпазу. Сировиною для одержання панкреатину служить підшлункова залоза свиней та рогатої худоби.

У підшлунковій залозі протеолітичні ферменти утворюються у вигляді проферментів: трипсиногена, хімотрипсиногена. Активування цих ферментів відбувається після гідролізу фрагмента поліпептидного ланцюга, що маскує активний центр протеїназ. При одержанні панкреатину активування проферментів підшлункової залози здійснюється в екстракті в лужному середовищі у присутності іонів кальцію із затравкою (панкреатин).

Тканини підшлункової залози подрібнюють на вовчках і заливають водою, яка підкислена оцтовою крижаною кислотою (5 мл на 1 л води). Настоювання триває у реакторі з мішалкою 4 год при температурі 10°С. Екстракт відокремлюють центрифугуванням чи проціджуванням з наступним пресуванням залишку. Для активування проферментів в екстракті створюють середовище зі значенням рН 8,1; додають хлорид кальцію до концентрації 0,05 М і затравку – панкреатин. Настоюють 24 год. при температурі 5°С. Потім екстракт підкислюють до значення рН 6,0 і в ізоелектричній точці осаджують. Осад відокремлюють, знежирюють ацетоном і висушують у вакуум-сушильній шафі при температурі не вище 40°С. Подрібнюють у кульовому млині.

Стандартизують панкреатин за протеолітичною активністю – здатністю гідролізувати казеїн у слабколужному середовищі. Панкреатин медичний має білувато-сірий колір, мало розчинний у воді, вологість його в залежності від наповнювача становить від 4,5 до 7,0%, зміст жиру не більш 2%, активність 25 – 33 ОД/г препарату. Застосовують при хронічних панкреатитах з недостатньою функцією підшлункової залози.

Колагеназа – протеолітичний фермент, що здійснює в лужному середовищі гідролітичне розщеплення білка сполучних тканин – колагену. Одержати колагеназу в очищеному стані дуже складно, тому що вона осаджується в комплексі з іншими протеолітичними ферментами, зокрема з еластазою.

Колагеназа здатна знижувати в'язкість розчинів проколагена шкіри телят, але в той же час зовсім не діє на інші тваринні білки, такі, як альбумін, казеїн, желатину, що свідчить про високу субстратну специфічність цього ферменту. Оптимальний рН для дії колагенази 6,5 – 7,8. Препарат чутливий до підвищення температури і підкислення середовища. Іони кальцію активують колагеназу, а іони магнію, кобальту, марганцю інгібують.

Панкреатопептидаза (еластаза) – фермент, що утворюється підшлунковою залозою і гідролізує еластинове волокно стінок артерій. Фермент активується трипсином. Очищений препарат панкреатопептидази складається з трьох компонентів, що здатні рухатися в електричному полі з різною швидкістю. Ці три компоненти мають різну субстратну специфічність. Специфічним субстратом для еластази І є еластин, для еластази II – колаген, що містить мукополісахариди, тому її часто називають колагенмукопротеїназой. Для еластази III субстратом є муколіпопротеїдний компонент аорти; цей фермент називається також еластомукопротеїназой. Співвідношення цих компонентів у комплексному препараті еластази: еластаза І – 60%; еластаза II – 24%, еластаза III – 16%.

Молекулярна маса еластази – близько 25000, ізоелектрична точка 9,5. Фермент термолабільний, найбільш стійкий при рН 6,0—8,5, не стійкий у кислому середовищі, стабілізується іонами кальцію. Еластаза здійснює гідролітичне розщеплення пептидного зв'язку, утвореного нейтральними амінокислотами з аліфатичними ланцюжками (такими, як лейцин, валін). Сприяє перетворенню протромбіну в тромбін. На думку багатьох дослідників, еластаза при дії на еластинові волокна викликає не гідролітичне розщеплення їх, а деполімеризацію, у результаті чого волокна еластину перетворюються в глобулярний білок. Крім того, еластаза звільняє проеластін від полісахаридів і ліпідів, з якими він зв'язаний і які складають близько 0,5% від білка еластину. Інгібується іонами міді, хлористого натрію і калію, сульфатом амонію і сироваткою людини.

Дезоксирибонуклеаза. Препарат є ліофілізованим білим порошком, легко розчинний у воді; значення рН 0,1% водного розчину становить 3,5 – 5,5. У водних розчинах фермент нестійкий (термін придатності 12 год.), термолабільний, інактивується при температурі 55°С. Активність визначають по утворенню кислоторозчинних продуктів, що звільняються препаратом із ДНК при певних умовах і виражають у одиницях активності. У 1 мг препарату повинно міститися не менш 1700 од.

Застосовується як засіб, що спричиняє деполімеризацію і розрідження гною і затримує розвиток вірусів, що містять ДНК (герпеса, аденовірусів). Призначають у виді аерозолів для інгаляцій. Випускають у герметично закупорених флаконах по 5, 10, 25 і 50 мг.

Зберігають у сухому, захищеному від світла місці, при температурі не вище 20 °С.

Рибонуклеаза. Ліофілізований порошок білого кольору, легко розчинний у воді. Активність визначають біологічним методом за кількістю кислоторозчинних речовин, що звільняються препаратом у результаті гідролізу кислоти рибонуклеїнової у визначених умовах. 1 Од відповідає 1 мг препарату. Застосовується місцево у вигляді аерозолів для інгаляцій, внутрішньоплеврально, внутрім’язево при захворюваннях, що супроводжуються гнійно-некротичними процесами.

Випускають у герметично закупорених флаконах. Зберігають у сухому захищеному від світла місці, при температурі не вище 15 °С

Трипсин і хімотрипсин є протеїназами, що гідролізують пептидні зв’язки, і відрізняються за місцем дії на поліпептидний ланцюжок. Адсорбційний центр трипсину ефективно взаємодіє з залишком лізіну/аргініну, результатом чого є гідроліз цього зв’язку. Оскільки ці амінокислоти містяться в більшості білків, трипсин здатний гідролізувати велику кількість білкових субстратів з утворенням мілких пептидів. Хімотрипсин діє на бокові ланцюги гідрофобних амінокислот (фенілаланін, триптофан, метіонін) і розщеплює їх до мілких пептидних фрагментів. Дані протеїнази належать до малоспецифісних протеїназ або до ферментів тотального гідролізу. Завдяки своїм властивостям трипсин і хімотрипсин важливі не лише для перетравлювання їжі, але й в знищенні чужорідного, в тому числі і атипового, білкового матеріалу. Особливо високу спорідненість ці ферменти мають до денатурованих білків, які утворюються в процесі запалення, оскільки їхні пептидні зв’язки є більш доступними для розщеплення. В зв’язку з цим трипсин і хімотрипсин знайшли своє застосування в хірургічній практиці при місцевому лікуванні ран.

Хімотрипсин – фермент, що міститься в підшлунковій залозі в неактивному стані у вигляді хімотрипсиногена. Відкритий Кунітцем М. і Нортропом І. X. та отриманий ними в кристалічному стані. Молекулярна маса хімотрипсиногена близько 25000.

З хімотрипсиногена (яких відомо два типи А та В) при активації можуть утворюватися різні форми хімотрипсинів. З хімотрипсиногена А при активації можуть утворитися π-, α-, β-, γ-, δ- і ε-хімотрипсини, а з хімотрипсиногена В - хімотрипсин В. Усі ці форми хімотрипсинів активні, але розрізняються формою кристалів, розчинністю, молекулярною масою. α-Хімотрипсин має молекулярну масу від 21600 до 27000. Молекулярна маса β-хімотрипсина 23000; γ-хімотрипсина – 15000–25000; хімотрипсина В – 22500. Молекула хімотрипсину утворена трьома поліпептидними ланцюгами, має еліпсоїдну форму і невисокий ступінь спіралізації.

В активний центр входить серін, зв'язування якого приводить до інактивації хімотрипсину. При впливі хімотрипсину на субстрат утворюються низькомолекулярні пептиди. Фермент здатний гідролізувати пептидні зв'язки, в утворенні яких беруть участь амінокислоти ароматичного ряду, він більш стійкий ніж трипсин, може згортати молоко.

При дослідженні хімотрипсину на колонках з карбоксиметилцелюлозой, встановлено, що він містить лише близько 3,0% активного ферменту, а неактивна частина являє собою суміш хімотрипсиногена В и неохімотрипсиногена В.

Хімотрипсин кристалічний – блискучі лусочки або порошок білого кольору, легко розчинний у воді, значення рН 0,2% водного розчину складає 4,5 – 6,5. Водні розчини швидко інактивуються. Застосовують як рибонуклеазу.

Випускають у герметично закупорених флаконах, що містять по 5 і 10 мг кристалічного хімотрипсину. Зберігають у прохолодному (не вище 10°С), захищеному від світла місці.

Трипсин – протеолітичний фермент, що відіграє важливу роль у процесі травлення. Цей фермент знаходиться в підшлунковій залозі у виді попередника ферменту – зимогену (трипсиногену). Під дією ентерокінази (протеолітичний фермент, що входить у кишковий секрет) у кислому середовищі трипсиноген порівняно швидко перетворюється в трипсин. Трипсиноген може активуватися і трипсином. Процес перетворення трипсиногена в трипсин може бути ускладнений побічними реакціями, що призводять до більш глибоких гідролітичних процесів, у результаті чого з'являється неактивний білок нестійкої будови. Цей побічний процес може привести до значних втрат трипсину. Процес перетворення трипсиногена в трипсин стимулюється іонами кальцію і рН середовища менше ніж 4,0. Щоб мати можливість з активованого трипсиногена одержати кристалічний трипсин, необхідно не допустити утворення неактивного білка й активних фрагментів трипсину, що мають меншу питому активність, ніж справжній трипсин. Для забезпечення нормального плину перетворення трипсиногена в трипсин необхідно дотримувати низку заходів: запобігання автолітичних процесів в сировині в період зберігання, недопущення домішок хімотрипсину і дотримання умов кристалізації трипсину.

Молекулярна маса трипсиногена 23040 – 23800. Він перетворюється в трипсин при відщіпленні поліпептидуізшістьма амінокислотними залишками з N- кінцевої частини пептидного ланцюга.

Трипсин кристалічний – пориста маса або порошок білого кольору, легкорозчинний у воді, значення рН 0,2% водяного розчину складає 3,0–3,5. У нейтральних і лужних розчинах препарат швидко руйнується. Застосовують як хімотрипсин.

Випускають у герметично закупорених флаконах або ампулах по 5 і 10 мг. Зберігають у сухому, захищеному від світла місці, при температурі не вище 10°С.