Носії афінного типу та їх специфічність

Носій	Специфічність
Білок А-сефароза СL-4В	Fс-область ІgG і подібних молекул
Кон А-сефароза	Кінцеві a-D-глюкопіранозильні, a-D-маннопіранозильні чи стерично схожі на них залишки
Сефароза 6МВ з імобілізованим лектином із проростків пшениці	N- Ацетил-D-глюкозамін
Роlу (U)-сефароза 4В	Нуклеїнові кислоти, особливо мРНК, що містять роlу (А)- послідовності; роlу (U)-зв'язуючі білки
Лізин-сефароза 4В	Плазміноген; рибосомна РНК
Блакитна сефароза СL-бВ	Широкий спектр ферментів, які мають нуклеотидні кофактори; сироватковий альбумін і ін.

 

Вони доступні у вигляді комерційних уже імобілізованих препаратів, у яких вони ковалентно приєднані до різних типів сефарози, яка представляє собою сферичні частинки гелю агарози. Так, наприклад, конканавалін А-сефароза представляє собою конканавалін А (Кон А), зв'язаний із сефарозою 4В бром ціановим методом. Кон А - це лектин (білок, здатний обернено взаємодіяти зі специфічними залишками сахаридів), який зв'язує манному, глюкозу та стерично схожі залишки. Таки чином, Кон А-сефароза може бути використана для очистки глікопротеїнів, які містять ці сахариди. Глікоферменти, які містять залишки маннози та глюкози, можуть бути імобілізовані адсорбцією на Кон А-сефарозі.

Ковалентне приєднання до сефарози, целюлози та поліакриламіду

Для ковалентного зв'язування ферменту з носіями потрібно, щоб носій був активований, завдяки чому було б можливим його хімічне зв'язування з ферментом. Прикладом такого методу імобілізації є ковалентне приєднання целобіози до сефарози та інвертази до целюлози та поліакриламіду.

Розповсюдженим способом імобілізації є ковалентне зв'язування ферментів із сефарозою, активованою бромціаном (БЦ). Цей носій доступний у вигляді комерційного препарату і імобілізацію ферменту на ньому можна здійснювати без попередньої активації. Активація сефарози заснована на реакції між БЦ і гідроксильними групами носія. Утворювані в результаті цього імідокарбонатні групи здатні реагувати з вільними аміногрупами ферменту.

Целобіазу приєднують до носія або через аміногрупи білкової частини молекули, або через залишки вуглеводів, так вона представляє собою глікопротеїн. Однак при ковалентній імобілізації глікопротеїнів можливі ускладнення, оскільки вуглеводні залишки можуть блокувати доступ бокових амінокислотних ланцюгів, які містять вільні аміногрупи, до активованих груп носія. Імобілізація через вуглеводну частину майже не впливає на ферментативну активність, оскільки при цьому практично не зачіпається білкова частина молекули ферменту, яка містить активний центр, тоді як імобілізація через білкову частину звичайно приводить до зниження ферментативної активності.

Приєднання інвертази до мікрокристалічної целюлози засновано на активації природних носіїв (наприклад, целюлози) солями перехідних металів (наприклад, хлоридом титану), які доступні як комерційні препарати.

При імобілізація біокаталізаторів необхідно звернути особливу увагу на рівномірність суспендування комплексу мікрокристалічна целюлоза-фермент перед відбором проби для визначення активності. Фермент, адсорбований на целюлозі та на зв'язаний із нею ковалентно, може бути видалений промиванням комплексу буфером, який містить 1,0 М NaС1.

До поліакриламідних носіїв, доступним у вигляді комерційних препаратів, належать носії типу ензакрил. Вони представляють собою сополімери акриламіду та різних похідних акриламіду (наприклад, ензакрили АА та АН, які містять ароматичні та гідразидні залишки відповідно). Після активації вони здатні ковалентно зв'язувати білки.

Імобілізація біокаталізаторів металохелатним методом

Найкращим способом імобілізації вважають утворення ковалентних зв'язків між молекулою та носієм. Однак цей спосіб, як правило, вимагає попередньої активації носія, тривалої інкубації для завершення реакції приєднання та спеціальних умов. Виявилося, що з метою проведення імобілізації швидко та в достатньо звичайних умовах, можна використовувати властивість перехідних металів утворювати хєлатні комплекси. Хоча є широкий вибір перехідних металів, найбільш підходящими для даного випадку властивостями володіють титан і цирконій, оксиди яких нетоксичні.

Імобілізація ферментів включенням їх у гель

Недоліком попередніх методів імобілізації є необхідність використання великої кількості каталізаторів. Крім того, хімічна модифікація, якої зазнають ферменти в процесі імобілізації, може небажаним чином змінювати їх каталітичні та інші властивості. З цієї причини багато дослідників, за висловом Нортона, «віддають перевагу включенню», коли клітини чи ферменти відділюють від решти об'єму включенням у носій чи інкапсулюванням. Таким чином каталізатор можна включати в полімерну сітку наприклад поліакриламідного гелю чи гелю альгінату кальцію, шляхом проведення полімеризації чи реакції поперечного зшивання гелю в присутності ферментів або клітин. Схожими методами є інкапсулювання в ліпосоми, нейлонові чи колодієві мембрани, а також їх фізичне відмежування від інших компонентів у апаратах для ультрафільтрації. Для полегшення роботи з частинками, які містять каталізатор, їм надають, як це можливо, сферичну форму.

За одностадійної каталізованої реакції імобілізують підходящий фермент. Для того, щоб збільшити ступінь включення та звести до мінімуму відтік ферменту, потрібна висока ступінь зшивки носія. Однак при високому ступені зшивки може обмежуватися дифузія молекул субстрату та продукту всередину частинок носія та з них назовні. Оскільки розміри клітин відносно великі, можна використовувати носії з низьким ступенем зшивки та, відповідно, з гарними дифузійними властивостями.

Поліакриламід – носій, що частіше за інші використовується для включення ферментів, – не характеризується іонообмінними властивостями, тому при імобілізації рН-профіль активності ферменту практично не змінюється. З цієї ж причини не відбувається ні збагачення, ні збіднення носія зарядженими субстратами та продуктами. Однак відсутність взаємодії включених білків із носієм не сприяє їх утриманню. Для усунення відтоку потрібен високий ступінь зшивки носія, тобто бажана якомога більш повна полімеризація (важливим фактором тут є видалення кисню з розчинів). На жаль, при високому ступені зшивки виникає проблема дифузійних ускладнень, особливо при роботі з великими молекулами субстратів. Таким чином, хоча включення ферментів у поліакриламідний гель використовується доволі широко, методи імобілізації, такі як ковалентне зв'язування з інертним носієм, мають у порівнянні з ним певні переваги.

Імобілізація ферментів шляхом мікрокапсулювання

На відміну від інших методів імобілізації, розглянутих вище, при мікрокапсулюванні головним є утримання розчину, що оточує фермент, а не створення фізичних і хімічних сил, необхідних для імобілізації. Імобілізуються повністю вихідний розчин, який містить фермент, а не окремі молекули ферменту. При мікрокапсулюванні використовують штучні капсули з мембранами, подібними до мембран природних клітин. За допомогою мембран здійснюється контроль розмірів молекул, що потрапляють усередину клітини чи тих, що виходять із неї. Великі молекули, такі як ферменти та білки, утримуються всередині мікрокапсули, тоді як малі молекули субстрату та продукту можуть вільно дифундувати через синтетичну мембрану. Однією з переваг мікрокапсулювання перед рівномірним включенням ферменту є велика площа поверхні, що припадає на одиницю активності імобілізованого ферменту, що дозволяє використовувати високі концентрації ферменту у вихідному розчині та досягати високої ефективності дії імобілізованого ферменту. Оскільки присутність у розчині ферменту не впливає на процес утворення мембран, можна одночасно мікрокапсулювати різні ферменти, клітини чи біомолекули, що дозволяє здійснювати багатостадійні реакції.

На сьогодні мікрокапсульовані продукти вже існують у вигляді комерційних препаратів, причому їх внутрішній вміст звичайно представляє собою чи органічний розчинник, який містить олію чи парфум, чи водне середовище, проте не проявляє каталітичну активність. Великі зусилля докладаються до вивчення контрольованого вивільнення ліків із мікрокапсул.

Діаметр мікросфер може бути від декількох мікрон до декількох тисяч мікрон, а товщина мембрани - від сотень ангстрем до декількох мікрон. Можна мікрокапсулювати в різних поєднаннях ферменти, кофактори з відповідними ферментами для їх регенерації, білки, цілі клітини, іонообмінні смоли, частинки активованого вугілля та магнітні частинки. Можливе включення маленьких мікрокапсул у великі (наприклад, маленькі мікросфери, які містять каталазу, включені у великі мікросфери з мембраною із бутадієнового каучуку).

Різні ферменти та кофактори можна заключати в капсули, обмежені мембраною, без втрати активності по відношенню до субстратів, які дифундують всередину капсули. Активність, яка зберігається при цьому, як правило, помітно нижча, ніж активність вільних ферментів. Справа в тому, що при інкапсулюванні ферменти стикаються з органічним розчинником і мономерами, які можуть їх легко денатурувати. Для того, щоб захистити фермент від інактивації, перед мікрокапсулюванням його звичайно змішують з полімерами, такими як бичачий сироватковий альбумін (БСА), гемоглобін або поліетиленімін (ПЕІ). Було досліджено вплив деяких водорозчинних полімерів: БСА, полівінілпіролідону (ПВП), полівінілового спирту (ПВС), поліетиленгліколю (ПЕГ), декстрану та гепаринату натрію, - на збереження активності аргінази при мікрокапсулюванні. Виявилося, що БСА, ПВП, ПВС і ПЕГ, як правило, сприяють збереженню активності аргінази, тоді як присутність декстрану та гепаринату натрію не має ніякого впливу. Вірогідно, гідрофобні ділянки полімерів першої групи екранують молекулу ферменту й тим самим захищають її в процесі мікрокапсулювання. Останні два полімери, що є надто гідрофільними, нездатні справити захисної дії. Для збереження активності суттєвим фактором є також концентрація полімеру. Показано, що активність аргінази краще за все зберігається при концентрації БСА 1% (маса/об'єм). Концентрація білку чи іншого полімеру важлива також для підтримання осмотичного тиску.

Концентрація емульгатора, що використовується для утворення мікросфер у органічному розчиннику, також помітно впливає на збереження активності ферменту. Активність мікрокапсульованої аргінази швидко спадає до нуля при зниженні концентрації емульгатора від 0,1 до 0,01% (за об'ємом). При його концентраціях вище 0,1% (за об'ємом) активність залишається постійною, що свідчить про існування критичної концентрації, необхідної для повного покриття поверхні краплин водної фази, завдяки чому фермент захищається від безпосереднього контакту з органічним розчинником. Безперервна регенерація кофакторів всередині мікрокапсули може бути забезпечена їх попереднім приєднанням до декстрану, після чого вони вже не здатні дифундувати через мембрану.