Препарати ферментів із сіменників.

Лідаза ( гіалуронідаза). Для одержання лідази подрібнені сіменники великої рогатої худоби обробляють 0,1 н розчином оцтової кислоти в співвідношенні 1:2 при температурі 10°С и перемішуванні протягом 4 год. Надосадову рідину відокремлюють і ацетоном осаджують фермент гіалуронідазу. Осад розчиняють у воді і процес осадження ацетоном повторюють три рази. Звільнений від ацетону осад очищеної гіалуронідази розчиняють у воді, фільтрують через стерилізуючі фільтри, розливають у флакони і висушують методом сублімації.

Основними показаннями до застосування лідази є контрактури суглобів, рубці після опіків і операцій, анкілозуючий спондилоартрит, гематоми. Розчин вводять під шкіру. Випускають у флаконах, що містять по 64 умовних одиниць стерильної сухої речовини. Зберігають у сухому, темному місці при температурі не вище 15°С.

 

Питання для самоконтролю:

1. Механіхм дії, джерела отримання та використання амілаз?

2. Основні етапи виробництва мікробних амілаз.

3. Вкажіть основні джерела отримання протеїназ.

4. Опишіть процес виробництва кристалічних препаратів протеїназ.

5. Основні етапи виробництва ліпаз.

6. Наведіть принципову схему одержання медичних препаратів галактозидази.

7. Охарактеризуйте продуцент ферменту глюкозооксидази.

8. Які етапи передбачає технологія виробництва препарату Мікроцид?

9. Які ферментні препарати медичного призначення отримують з тваринної сировини?

10. Механізм дії та застосування протеїназ з тваринної сировини.

 

ІМОБІЛІЗОВАНІ ФЕРМЕНТНІ ПРЕПАРАТИ

Широке використання ферментних препаратів в медицині стримується їхньою низькою стабільністю при зберіганні, швидкою інактивацією під впливом внутрішнього середовища організму, сильними імунологічними реакціями, високою вартістю і неможливістю регенерації. Ці недоліки можна усунути використовуючи імобілізовані ферментні препарати.

Імобілізовані ферменти можуть бути використані для діагностики і лікування різних захворювань, а також для створення більш досконалих протезів і апаратів, що заміщають роботу важливих органів людини. Тому дослідження в галузі імобілізації ферментів і клітин надзвичайно важливі й, очевидно, збережуть своє значення в найближчому майбутньому.

Процес імобілізації біологічного матеріалу можна визначити як включення біоселективних молекул до ізольованої фази, яка відокремлена від фази вільного розчину, але яка може обмінюватися з нею молекулами субстратів, продуктів, ефекторів або інгібіторів.

Історія імобілізації ферментів бере свій початок у 1916 р., коли Нельсон Дж. і Грифін Є. показали, що інвертаза, адсорбована на вугіллі, зберігає свою каталітичну активність. У 20 – 30-х роках XX ст. вивчення адсорбції білків і ферментів було продовжено. У 1939 р. Пфанмюллер Дж. і Шлейх Г. отримали перший патент на застосування адсорбованих на дерев'яній стружці протеолітичних ферментів для обробки шкір. У 1949 р. Майкл і Юерс використали азидну похідну сполуки карбоксиметилцелюлози для імобілізації низки білків. Однак важливі експерименти в цій галузі не проводилися до 1954р. доки Грубховер Н. і Шляйт Д. не запропонували діазопохідні полі-аміностиролу для імобілізації пепсину, амілази й карбоксипептидази. У середині 1960-х р. були опубліковані перші праці з аналітичного застосування імобілізованих ферментів. У 1965 р. Гілболт Г. включив холінестеразу у крохмальний гель, який потім було нанесено на поліуретанову пластинку й використано для визначення органофосфорних сполук у повітрі.

Імобілізовані ферменти мають низку істотних переваг:

1) гетерогенний каталізатор (фермент) можна легко відокремити від реакційного середовища, що дає змогу зупинити в необхідний момент реакцію, застосувати його повторно та отримати чистий продукт, не забруднений ферментом;

2) використання імобілізованих каталізаторів робить можливим проведення ферментативного процесу безперервно, наприклад у проточному реакторі, і регулювання швидкості каталізованої реакції та виходу продукту зміною швидкості протоку;

3) імобілізація ферментів дає можливість регулювати їх каталітичну активність, змінюючи властивості носія під впливом деяких фізичних чинників, таких як світло, звук, тощо;

4) імобілізація та/чи модифікація ферментів полегшує цілеспрямовану зміну властивостей каталізатора, включаючи специфічність, залежність каталітичної активності від рН, іонного складу та інших параметрів середовища.

 

Матеріали для імобілізації ферментів

Матеріали, що використовуються для імобілізації ферментів, повинні мати наступні властивості: нерозчинність, висока хімічна і біологічна стійкість, значна гідрофільність, проникність для кофакторів, субстратів та продуктів реакції. Жоден із відомих носіїв не відповідає в повному обсязі цим вимогам. Але існує досить значна кількість носіїв придатних для імобілізації певних ензимів в конкретних умовах.

В залежності від походження носії поділяють на органічні і неорганічні. Імобілізація багатьох ферментів здійснюється на полімерних носіях, які поділяють на природні та синтетичні. Серед природних полімерів виділяють білкові, полісахаридні та ліпідні носії, серед синтетичних – поліметиленові, поліамідні і поліефірні.

Перевагою природних носіїв є доступність, поліфункціональність і гідрофільність, недоліками – висока вартість та швидка біодеградація. З полісахаридів для імобілізації найчастіше використовують целюлозу, декстран, агарозу та їх похідні. Серед білків практичне значення в якості носіїв ферментів мають структурні білки, а саме кератин, колаген і продукт переробки колагену – желатина.

Серед синтетичних полімерних носіїв найпоширенішими є полімери на основі стиролу, акрилової кислоти, полівінілового спирту. Більшість синтетичних полімерів мають достатню міцність і можуть бути виготовлені в різних фізичних формах (труби, волокна, гранули).

В якості носіїв неорганічної природи часто використовують матеріали зі скла, глини, кераміки, графітової сажі, силікагелю, а також оксиди металів. Основна перевага неорганічних носіїв – легкість регенерації.

Реагенти, які найчастіше застосовують при імобілізації, – це багатофункціональні агенти (глутаровий альдегід, гексаметилдіазоціанат), що утворюють ковалентні зв'язки між біокаталітичними частинками чи білками, а також різні полімери (поліакриламід, поліфенол), які формують структури, подібні до сітки для захоплення та утримання біологічного матеріалу.

Використовують також органічні електропровідні полімери. Їхньою перевагою є те, що під час імобілізації біологічного об'єкта на електроді утворюється поверхня, яка має електричний контакт з металевим або вуглецевим провідником. У результаті електричний контакт між редокс-центром ферменту та поверхнею електрода стає більш тісним. Такі полімери можна отримати в різних хімічних процесах, а саме за реакцією Зиглера-Натта для поліацетилену, одержання органометалевих компонентів (політіофену), окиснення мономерів, тощо.

Для захоплення оксидоредуктаз застосовували редокс-полімерні гідрогелі. Процес ґрунтувався на зв'язуванні поліетиленгліколю, діакрилату та вінілфероцену за допомогою ультрафіолетового ініціатора. Фермент розчиняли в такій суміші безпосередньо перед опроміненням. Під час імобілізації біомолекул використовували також латексні частинки. Автори вивчили формування латексної двовимірної мембрани на електропровідній твердій поверхні під час імобілізації сироваткового альбуміну крові людини.

Для додаткових зовнішніх мембран, що виконують функції дифузійного контролю, механічного захисту для зменшення впливу інтерферуючих частинок, застосовують різні комерційні полімери: полівінілхлорид, поліетилен, поліметакрилат, нафіон, поліуретан.