Зберігання штамів-продуцентів

Важливе значення для промислового отримання антибіотиків, а також для лабораторних досліджень продуцентів мають методи підтримання життєздатності організмів, що дозволяють зберігати їхню антибіотичну активність на постійному рівні.

Відомо, що мікроорганізми легко змінюються у разі тривалого зберігання. При цьому досить часто спостерігається повна або часткова втрата антибіотичних властивостей.

В технології антибіотиків використовують надсинтетики – мікроорганізми, які можуть утворювати антибіотики у великій кількості. Ці культури дуже вразливі і часто втрачають або різко знижують здатність утворювати великі кількості антибіотику. Це відбувається, як правило, з двох причин:

1) спонтанна дисоціація: продуценти – це гетерогенні культури, які складаються з багатьох варіантів, що відрізняються за рівнем біосинтезу. Внаслідок спонтанних мутацій можуть утворюватись малоактивні продуценти (варіанти). Наприклад, в культурі B.brevis (граміцидин С) може утворюватися 4 варіанти R, S, P⁺, P^-. Тільки R і Р⁺ активні щодо антибіотикоутворення.

2) фаголізис: призводить до повного припинення росту культури і, відповідно, до зупинки процесу утворення антибіотика, особливо при культивуванні актиноміцетів (стрептоміцин, новобіоцин).

Найбільш поширеними методами зберігання продуцентів антибіотиків (ферментів та інших біологічно активних речовин) є наступні:

1. Зберігання культур при низьких температурах (від 4 до -5°С).

2. Зберігання культур на агаризованих середовищах під шаром вазелінової олії. В таких умовах мікроорганізми можуть зберігатися до 5 років.

3. Зберігання спор у вигляді водних суспензій в запаяних ампулах.

4. Зберігання вегетативних клітин або спор мікроорганізмів в стерильному ґрунті, піску або на насінні деяких рослин (просо). В стерильному ґрунті клітини стрептоміцетів зберігають життєздатність протягом 30 років.

5. Ліофілізація клітин (висушування з замороженого стану).

6. Висушування під вакуумом з рідкого стану (L- висушування клітин).

7. Кріоконсервація. Зберігання мікроорганізмів в рефрижераторах з азотом двох типів: газофазовим (-130, -170°С) і рідким (-196°С).

Зберігання на агаризованих середовищах – це економічний і надійний метод. Полягає в постійному пересіві культури на свіже поживне середовище. Негативним є те, що метод потребує великих затрат праці і може призвести до втрати основних біосинтетичних властивостей культури (відбувається утворення низькоактивних варіантів, які в подальших пасажах можуть поступово витіснити високоактивні форми). Для попередження цього процесу необхідно відбирати генетично більш однорідний матеріал, використовувати селективні середовища, додавати стимулятори біосинтезу антибіотиків.

В процесі зберігання при пасажах, особливо на багатих середовищах, може відбуватися спонтанний фаголізис продуцента. Вражені фагом продуценти різко знижують або втрачають свою активність. Щоб попередити фаголізис в поживне середовище додають 10М розчин цитрату натрію або 0,03М розчини оксалатів. Попередити фаголізис можливо також шляхом пасажей на синтетичних середовищах.

Зберігання культур активних продуцентів на агаризованих середовищах відбувається при температурі 5-7ºС. Для уповільнення висихання агару ватяні пробки заливають парафіном. В такому вигляді культура може зберігатися майже без змін 12 місяців.

Зберігання штамів в стерильному ґрунті.

Використовують садовий ґрунт. Його подрібнюють, просіюють і вносять в пробірки в кількості 1-2 г, додають 2-3 краплі води, закривають ватяними пробками та двічі стерилізують протягом 1 години при 120ºС з перервою в 1 добу, при цьому пробірки зберігають в термостаті при температурі 26-28ºС. В стерильний ґрунт закладають спори і зберігають досить тривалий час при температурі 4ºС або в замороженому стані.

В цьому випадку можна використовувати не лише садовий ґрунт, а ґрунт в суміші з кварцевим піском або сам пісок.

Зберігання штамів на зерні.

Використовують як подрібнене, так і не подрібнене зерно. Як правило, пшоно. Пшоно заливають окропом і кип’ятять до повного поглинання зерном вологи. На 1 кг зерна потрібно 800 мл окропу. Ємність обгортають папером, ватою і витримують 30 хв., після чого пшоно охолоджують і розсипають в стерильні флакони (250 мл). Ці флакони стерилізують при 115ºС протягом 40 хв.

Пшоно засівають суспензією спор або вегетативним міцелієм. Флакони ретельно струшують, щоб клітини рівномірно розподілились на зерні.

Найкращою формою зберігання мікроорганізмів, за якої не втрачається їхня антибіотична активність, вважається ліофілізація.

Суть методу: суспензія клітин або спор мікроорганізму, приготовлена на багатому на білки середовищі, швидко заморожується при температурі від -40 до -60°С і висушується під вакуумом до залишкової вологості 0,5-0,7%. Після цього ампули ліофілізованого мікроорганізму запаюють. Ліофілізовані бактерії зберігаються 16-18 років, спори грибів – 10 років.

Однак необхідно пам’ятати, що для кожного продуцента необхідно підбирати свій метод зберігання. За використання будь-якого способу зберігання не виключено можливість появи спонтанних мутацій, тому завдання збереження вихідного рівня антибіотичної активності продуцентів не може бути повністю вирішено лише методами консервації культур. Для підтримання активності культур-продуцентів антибіотиків використовують комплекс заходів, який передбачає підбір найкращих методів зберігання, культивування на спеціально підібраних для кожного штаму-продуценту середовищах, і, головне, здійснення безперервної селекції найбільш активних форм продуцента з розсівів популяції продуценту на аграгизованих середовищах. Одержану в результаті селекції колонію продуценту, антибіотична продуктивність якої не нижче, заявленої в паспорті продуценту, використовують для приготування новой партії штаму-продуценту на агаризованому середовищі в пробірках. Після підтвердження високої активності приготовленої партії її втикористовують для виготовлення засівного матеріалу і закладають на зберігання різними способами. Цю ж партію перевіряють на відсутність сторонніх мікроорганізмів.

Система депонування штамів-продуцентів

Депонування активних штамів-продуцентів антибіотиків, ферментів та інших біологічно-активних речовин здійснюється з метою проведення патентної процедури, зважаючи на те, що активний штам-продуцент – це інтелектуальна власність і вона повинна бути захищена.

Порядок депонування затверджений наказом Держпатенту України та Національної академії наук України в 1995 році і викладений у відповідній інструкції. Інструкція регламентує порядок прийняття на депонування, реєстрації, обліку, зберігання штамів мікроорганізмів та видачі їх зразків зацікавленим особам відповідно до закону України «Про охорону прав на винаходи і корисні моделі».

Система депонування активних штамів-продуцентів антибіотиків передбачає реєстрацію, зберігання, перевірку, підтримку життєдіяльності активних штамів – продуцентів в державному депозитарії. Ті особи, які хочуть отримати штами з депозитарію, повинні сплатити кошти. В Україні депозитарій знаходиться на території Інституту мікробіології і вірусології НАН України ім. Д.К.Заболотного. Депозитарій має право вносити зміни до таксономічного визначення штаму та уточнювати його науковий опис. Паспорт штаму мікроорганізму повинен включати видову (родову) назву штаму, номер, родовід, культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні властивості, інформацію про наявність патогенних властивостей тощо, необхідні вказівки на умови культивування, зберігання, реактивації, способів перевірки життєздатності та специфічної активності штаму.

Депозитарій видає культуру з паспортом. Особа, яка придбала культуру в депозитарії, не має право передавати штам іншим особам або установам.