Визначення протипухлинної дії антибіотиків

Для визначення протипухлинної активності культуральної рідини використовують безпосередньо пухлинні клітини. З цією метою використовують методи, що базуються на використанні експериментальних тварин, культури тканин чи вільноживучих в окремих полостях організму пухлинних клітин (асцитні клітини), але кінцевий висновок про антипухлинну дію антибіотика надають лише після дослідів на тваринах.

Використання експериментальних тварин

В якості тест-об’єкта використовують клітини асцитного раку Ерліха у мишей. Суспензію асцитних ракових клітин змішують з рівним об’ємом досліджуваного антибіотичного препарата і суміш поміщують в рефрижератор при 4°С на 4 год, після чого її перевивають мишам підшкірно.

Для контрольних тварин замість досліджуваного препарату використовують фізіологічний розчин. Через 10 днів мишей забивають і визначають наявність пухлини і її розміри. Якщо досліджувана речовина вбиває асцитні ракові клітини, то вони відповідно не утворюють пухлин.

Тест-об’єктом можуть бути також інші пухлинні клітини.

Використання мікроорганізмів для пошуку протипухлинних антибіотиків

Обмін речовин в пухлинних клітинах відрізняється від обміну нормальних клітин. Зокрема, різниця визначається інтенсивністю дихання, в пухлинних клітинах воно значно знижене. Виходячи з цього було висунуто припущення про можливість використання в якості тест-об’єктів для пошуку протиракових антибіотиків мутантних мікроорганізмів зі зниженим коефіцієнтом дихання.

Після оброблення клітин стафілококів, кишкової палички та дріжджів було отримано мікроорганізми, коефіцієнт дихання яких становив 20-80% порівняно з вихідними культурами.

Необхідно зазначити, що біохімічні мутанти є більш чутливими до дії протипухлинних антибіотиків, ніж асцитні клітини Ерліха.

Використання рослинної тест-системи

Бактеріальний рак – одне з найбільш поширених і шкідливих захворювань рослин в багатьох країнах світу. Широке розповсюдження бактеріального раку та його велика шкідливість вимагає пошуку нових ефективних методів боротьби з ним. Але значний інтерес до цього захворювання та його збудника пояснюється не лише його шкодочинністю, а й близькістю механізмів пухлиноутворення у рослин і новоутворення у тварин і людей. Утворення пухлин – це найскладніший процес, характерний для всіх багатоклітинних організмів. Серед усіх пухлин рослин тільки корончасті гали, зумовлені вірулентними штамами Agrobacterium tumefaciens, мають характерні біологічні особливості злоякісних пухлин, а саме: метаболітну автономію, гормононезалежний ріст і трансплантабельність. Тому їх можна вважати справжніми злоякісними пухлинами рослин – фітобластомами.

Бактерії роду Agrobacterium – аеробні грамнегативні неспороутворюючі палички 0,6-1,0 х 1,5-3,0 мкм, рухливі за допомогою перитрихіально розташованих джгутиків. На КА вони утворюють вологі блискучі світло-бежеві колонії з рівним краєм. Іноді можуть утворюватися колонії шероховатої форми. Ріст на середовищах із вуглеводами супроводжується рясним утворенням позаклітинного полісахаридного слизу. Желатину не розріджують, оксидазопозитивні. Оптимальна температура росту 25 – 30°С, максимальна –37°С. Оптимальний діапазон рН 6,0 – 9,0.

У клітинах вірулентних штамів A. tumefaciens містяться великі (200 – 250 т.п.н.) плазміди. Це так звані Ті (tumor inducing) -плазміди. На ДНК Ті-плазміди припадає близько 4% всієї ДНК A.tumefaciens. Частина цієї плазміди, названа Т-ДНК (transfered), інтегрується в геном рослини і переносить інформацію, яка забезпечує основні пухлинні характеристики зміненим клітинам.

В останні десятиріччя пухлини рослин, спричинені A. tumefaciens, стали об'єктом детального вивчення, оскільки вони є легковідтворюваною моделлю пухлинного росту, якій притаманні всі ознаки пухлин тварин. Для скринінгу протипухлинних речовин використовують індукцію пухлиноутворення за допомогою A. tumefaciens на різних тест-рослинах: експлантатах запасаючих органів моркви, картоплі та топінамбуру (рис. 2.3). Перевагами використання такої моделі пухлиноутворення є висока специфічність, незначна, порівняно з тваринними системами, тривалість проведення досліду. Використання моделі індукції пухлиноутворення за допомогою A. tumefaciens дає можливість здійснювати пошук сполук із протипухлинною активністю з мінімальними витратами та зменшити потребу у тваринних системах, які вимагають значних витрат коштів.

 

Рис. 2.3. Розвиток пухлин на експлантатах картоплі: 1 – експлантати, оброблені протипухлинною речовиною, 2 – не оброблені експлантати.

 

З літератури відомо, що протипухлинні препарати, які запобігають утворенню корончастогалових пухлин на експлантатах картоплі, мають також протилейкемічну активність в експериментах з мишами, хворими на лейкемію. Показано, що відомі протипухлинні речовини здатні запобігати зумовленому A. tumefaciens пухлиноутворенню. Деякі з цих речовин (5-йод-2'-дезоксиурідин, арабінозид цитозину) повністю подавляють пухлиноутворення, а інші (2'-гідрокси-4',5'-диметил-4-формілазобензен у суміші з 1,2-дихлор-4-бензен-сульфонамід-5-нітробензеном) приводять до зменшення кількості пухлин.