Попереднє оброблення культуральної рідини, виділення і хімічна очистка антибіотиків

В процесі розвитку продуценту утворюваний ним антибіотик в більшості випадків повністю виділяється з клітин в середовище. Однак в деяких випадках частина антибіотика може залишатися в клітинах продуцента або антибіотик повністю накопичується внутрі клітин продуценту.

В залежності від місця накопичення антибіотика підбирають методику його виділення. Так, якщо антибіотик знаходиться в культуральній рідині, його виділяють методами екстрагування, використовуючи з цією метою розчинники, що не змішуються з водою, осаджують у вигляді нерозчинної сполуки або сорбують іонообмінними смолами.

З клітин мікроорганізмів антибіотики виділяють екстрагуванням органічними розчинниками. При цьому досить часто клітини продуцентів-бактерій необхідно руйнувати, тоді як мікроміцети мають більшу проникність клітин, і антибіотик може бути екстраговано з неушкоджених клітин. Методи руйнації клітин поділяють на:

а) механічні – балістичні, екструзійні (продавлювання з піском);

б) фізичні – термошок, осмотичний шок, дія ультразвуку, процес заморожування-танення, просте висушування клітин;

в) хімічні – дія кислот, лугів, ПАР;

г) ензиматичні – дія літичних ферментів (дріжджолітин);

д) біологічні – дія антибіотиків, дія фагів;

е) дія речовин, що призводять до інгібування біосинтезу клітинної оболонки.

Якщо антибіотик міститься в культуральній рідині і клітинах мікроорганізму, то спочатку його переводять у фазу, з якої його найбільш доцільно виділяти. Наприклад, антибіотик, що міститься у культуральній рідині, і клітини, що містять антибіотик, переводять в осад, з якого екстрагують антибіотик.

Відділення нативного розчину, що містить антибіотик, від біомаси та зважених частинок здійснюють методами фільтрації і центрифугування.

Основний метод – фільтрація. Для покращення фільтрації застосовують кислотну або теплову коагуляцію, обробку електролітами. Для великих об’ємів використовують фільтрпреси (під тиском), для малих – нутч-фільтри (під вакуумом) або друк-фільтри (підвищений тиск над рідиною, що фільтрується).

Дуже широко використовується також центрифугування. Добрі результати отримано і за використання сепараторів.

В залежності від властивостей антибіотика та методів його подальшого виділення та очищення обирається спосіб попередньої обробки культуральної рідини. При застосуванні екстракційного методу виділення антибіотика з рідини (пеніцилін), нативний розчин повинен бути максимально звільнений від домішок, які здатні утворювати стійкі емульсії з органічними розчинниками. Білкові домішки, що утворюють стійкі емульсії, як правило, видаляють разом з міцелієм, або іншими методами (хімічним способом або нагріванням рідини (денатурація білка)). Якщо міцеліальна маса видаляється легко, без попередньої обробки, то до нативного розчину додають деемульгатори, які утримують білкові речовини у розчинному стані при екстракції. Якщо антибіотик виділяють методом осадження, то із нативного розчину бажано видалити всі домішки, що здатні в цих умовах перейти в осад. Піногасники, особливо жирові, погіршують якість фільтрації.

Заходи, що використовуються для покращення фільтрації:

- кислотна коагуляція;

- теплова коагуляція;

- введення у рідину електролітів;

- використання наповнювачів, покращувачів фільтрації.

Мета хімічної очистки – видалення антибіотика з нативної рідини, його концентрування і звільнення від супутніх домішок для отримання високоочищеного препарату. Очистка антибіотиків – це дуже важливий етап, оскільки кількість домішок сягає в культуральній рідині іноді до 99%.

Основні методи очищення – це екстракція, осадження, сорбція на іонообмінних матеріалах. Антибіотики лабільні речовини, вони інактивуються під впливом температур, рН та інших факторів, що необхідно враховувати під час розробки методів їх очищення.

Очистка може здійснюватись багаторазовим переведенням антибіотика з одного розчинника в інший з використанням попереднього осадження – перекристалізація. Кристалізація – принцип полягає у різкому зменшенні розчинності в результаті зміни температури розчину, як правило, пониження (виняток – еритроміцин, підвищення) чи завдяки переводу антибіотика в іншу хімічну форму, менш розчинну. Це досягається зміною рН середовища, чи додаванням відповідного реагенту. Цей метод комбінують з осадженням і сорбцією.

Іонообмінна сорбція – водні розчини антибіотика, який за своєю хімічною природою є кислотою, лугом, амфотерною сполукою, пропускають крізь колонки з відповідними іонообмінними смолами. Антибіотики сорбуються на смолах, а розчин з домішками, які мають заряд, протилежний заряду антибіотика, проходить крізь колонку. Смоли, в залежності від їхнього заряду, називають катіонітами і аніонітами. Може бути здійснений також протилежний процес – сорбція домішок. Потім за допомогою специфічних елюентів (розчини, які порушують зв'язок антибіотика зі смолою) здійснюють процес десорбції.

Метод осадження – базується на зв’язуванні антибіотика з органічними або неорганічними речовинами з метою отримання нерозчинного осаду, який, як правило, за допомогою центрифугування відділяють і висушують. Осадження – найбільш розповсюджений метод у виробництві тетрациклінових антибіотиків.

Екстракція – цей метод базується на різній розчинності різних хімічних форм антибіотика у воді та органічних розчинниках, що не змішуються з водою. Наприклад, переведення пеніциліну із солевої форми у кислотну та навпаки, що досягається зміною рН розчину, забезпечує перехід з одного розчинника в інший при їх контакті. Межі значення рН повинні забезпечувати достатньо повний перехід у відповідну хімічну форму при мінімальній його інактивації.

Концентрування очищених розчинів антибіотика відбувається за допомогою вакуум-випарювання через лабільність останнього.

Сушіння і фасування препаратів

Сушіння антибіотиків, зважаючи на термолабільність, може відбуватись за допомогою:

- ліофільної сушки;

- розпилювальної сушки;

- у вакуум-сушильних шафах.

Сублімаційна (ліофільна сушка). Метод сублімаційного зневоднення дозволяє отримати продукти найвищої якості, оскільки в них повністю зберігається біологічна активність.

В процесі основного зневоднення матеріал знаходиться в замороженому стані, тому мікроструктура і властивості матеріалу зберігаються в максимальному ступені. Препарати, висушені цим методом зберігають початковий об’єм і легко поглинають вологу при зволоженні, зберігають колір, запах та інше.

Переваги: волога видаляється при низьких температурах, що практично виключає термоінактивацію продукту;

зберігається стабільна структура матеріалу (не відбувається руйнування або конгломерації частинок);

практично виключається видалення летких компонентів матеріалу, що висушується, порушення його хімічного складу;

полегшується можливість отримання сухого продукту, упакованого у стерильному вигляді.

Недоліки: складність сублімаційного обладнання; тривалість і енергоємність процесу.

Розпилювальне сушіння.

Відбувається при високих температурах. Розчин антибіотика пневматично розпилюється до мікрокраплинок в камері з потоком нагрітого повітря. Процес сушіння антибіотиків триває декілька секунд. За таких умов зберігаються навіть термолабільні препарати.

Вакуумна сушка.

Сушіння при низьких температурах (30-35^○ С). Дешевий та ефективний метод. Недоліки: отримання матеріалу у вигляді коржа; не можна піддавати такому сушінню рідини; малоефективний, оскільки є необхідним великий обсяг площ.

Завершальний етап роботи – розфасовка та пакування готового препарату. На упаковці антибіотика вказують біологічну активність, дату виготовлення і термін зберігання.