Культивування мікроорганізмів для одержання ферментів.

Для отримання ферментних препаратів в промисловості з використанням мікроорганізмів застосовують глибинний, поверхневий, гетерофазний методи культивування.

Поверхневе культивування. Найбільш старий метод отримання ферментних препаратів. Переваги – простий, продукт отримується у концентрованому вигляді. Недоліки – обмеженість продуцентів (переважно використовується для міксоміцетів), неможливість проводити оперативний контроль і втручання в процес культивування.

Вихідна культура готується у вигляді засівного матеріалу трьома способами: на твердому середовищі; на рідкому середовищі; у вигляді спор.

Приготування поживного середовища зводиться до подрібнення компонентів, їх змішування, зволожування і стерилізації. Вологість поживного середовища 65-75%. Ріст продуценту відбувається за вологості 35%, але це значення несприятливе – воно оптимальне лише для отримання спорового матеріалу. Якщо підвищити значення вологості більше 75%, то це ускладнить аерацію.

Аерація при поверхневому культивуванні має три функції: постачання кисню для культури; видалення газоподібних продуктів обміну; видалення фізіологічного тепла.

Щоб не гальмувати масообмінні процеси середовище має бути сипким. Для цього використовують певні наповнювачі, такі як тирса. Для зволоження використовують слабкі розчини соляної, сірчаної та молочної кислот. рН культивування 4,5-5,0 (для мікроміцетів).

Біомаса

Деградація клітин (механічна, гідродинамічна, УЗ, ферментативна)

	Відділення екстракту від зруйнованих клітин (центрифугування, сепарація, мембранна фільтрація)		Очищення цільового продукту

1 – внутрішньоклітинні ферменти; 2 – позаклітинні ферменти

 

Рис. 12.1. Загальна схема отримання ферментів біотехнологічним методом.

Таким чином створюються оптимальні умови для розвитку мікроміцетів. Режим повітрообміну пов’язаний з фазами росту мікроміцетів:

1. набухання конідій та їх проростання триває 12 годин. Аерація 4-5 обсягів повітря на 1 обсяг камери за годину.

2. Фаза активного росту міцелію триває 12-40 годин. Відбувається інтенсивне споживання поживних речовин, аерація становить 30-60 обсягів на 1 обсяг камери за 1 годину. Температура знижується на 2-3ºС.

3. Фаза накопичення фермента. Температура знижується на 3-4 ºС і повітрообмін в 5 разів нижчий, ніж в попередній фазі.

Найбільш розповсюджені складові поживного середовища: соєве борошно, крохмаль, кукурудзяний екстракт, меляса, солодові паростки, буряковий жом, біомаса інших мікроорганізмів або ферментолізати біомаси бактерій.

Культура розміщується в кювети, етажерки і надходить в ростильні камери. В камерах за підвищеної вологості та температури вирощування триває до 5 діб.

Після того як культивування закінчено, культуру підсушують і з кювет вона надходить до загального бункера, з якого поступає на подрібнення. Після цього культура надходить на стадію екстракції фермента. Всі наступні операції пов’язані з відділенням ферментного білка від баластних речовин – це є залишки поживного середовища (неутилізовані джерела поживних речовин), продукти метаболізму клітини, самі клітини (біомаса). Від великих частинок позбавляються фільтруванням, сепарацією або центрифугуванням. Розчинені ж речовини видаляються важко. Основою методів видалення та очищення ферментів є використання фізико-хімічних властивостей самих ферментів. Мікроміцети видаляють на фільтрпресі автоматичному камерному. Також додають коагулят, щоб полегшити фільтрування (додають речовини з великим розміром часток – кізельгур, фільтроперліт, різні глини, каолін, тому що маленькі частки забивають пори). Бактеріальні культури видаляються центрифугуванням.

Глибинне культивування. Переваги – необмеженість в асортименті продуцентів, можливість оперативного контролю процесу культивування і при необхідності можливість втручання в процес. Недоліки – отримання дуже розбавленої системи (концентрація цільового продукту незначна).

Приготування засівного матеріалу відбувається в рідкому стані. Якщо використовується культура з великою питомою швидкістю росту, то засів може здійснюватися з колб, а якщо з невеликою, а об’єм поживного середовища значний, то використовують інокулятори першого, другого та третього ступенів. Поживні середовища для інокуляції і ферментації дуже часто ідентичні.

У разі отримання гідролітичних ферментів потрібно мати на увазі, що більшість з них є індуцибельними, тому до складу середовища обов’язково включають речовину, яка є індуктором синтезу ферменту. Наприклад, для отримання галактозидази в середовище вводять лактозу.

Велике значення для біосинтезу ферментів має співвідношення вуглецю та азоту в середовищі, тобто збалансованість поживного середовища. Дефіцит одного з цих компонентів не може бути компенсовано за рахунок іншого. Для більшості продуцентів ферментів оптимальне значення співвідношення C:N знаходиться в межах 18 – 34.

Якщо продуцентом є ауксотрофний організм, необхідно особливу увагу приділити введенню в середовище ростових речовин та вітамінів необхідних для його розвитку.

Макро- та мікроелементи також є невід’ємною складовою поживного середовища. Іони металів часто входять до активного центру ферментів чи приймають участь у підтримання їхньої просторової структури. Потреба мікроорганізмів-продуцентів у макроелементах забезпечується введенням відповідних солей, мікроелементів – водогінною водою, рослинними відварами і інше.

В якості компонентів поживного середовища при глибинному культивуванні доцільно використовувати відвари і гідролізати рослинних відходів (висівки, солодові ростки, буряковий жом і інше), а також фільтрати спиртової барди, гідролізати мікробної маси, тобто речовини, які не містять нерозчинних компонентів. Поживні середовища готують на водогінній воді, вміст сухих речовин в них коливається в межах 2,5 – 20,0%.

Перед засівом поживне середовище обов’язково має бути простерилізоване. Стерилізацію поживних середовищ можна здійснювати двома способами: періодичним та безперервним. Періодичну стерилізацію використовують при роботі з невеликими об’ємами середовища і здійснюють безпосередньо у ферментері. В такому випадку процес відбувається в декілька етапів:

1. стерилізація ферментера і комунікацій гострою чи глухою парою;

2. наповнення апарату підготовленим середовищем;

3. нагрів середовища до температури стерилізації;

4. витримування при температурі стерилізації для загибелі мікроорганізмів;

5. охолодження стерильного поживного середовища.

Найчастіше в такому випадку стерилізація відбувається при надлишковому тиску 0,05 –0,1 Мпа температурі 110 – 120 °С протягом 1 – 1,5 год.

У разі безперервної стерилізації використовують більш високі температури (140 - 145 °С), але зменшують тривалість витримування до 1 – 10 хв. Безперервна стерилізація здійснюється в спеціальних установках, які, зазвичай, об’єднують три апарати для здійснення трьох етапів стерилізації.

Для процесу глибинного культивування має велике значення стерилізація та герметизація апаратів та комунікацій.

На стадії стерилізації відбувається постійний мікробіологічний контроль стерильності поживного середовища, стисненого повітря, піногасника і інше.

Для засіву виробничого середовища при глибинному культивуванні засівний матеріал готують також глибинним способом. Принципова схема приготування засівного матеріалу наведена на рис. 12.2.

Засівний матеріал вносять в ферментер в кількості від 1 до 15%, тому кількість засівного матеріалу (і відповідно кількість стадій його вирощування) визначається продуктивністю підприємства. Готовий засівний матеріал відразу передають на виробничу ферментацію. У разі затримки засівний матеріал охолоджують до 8 -10 °С і зберігають, але не більше 2-3 год.

Рис. 12.2. Принципова схема приготування засівного матеріалу при глибинній ферментації

 

Контролювання процесу ферментації передбачає здійснення технологічного, хімічного та мікробіологічного контролю.

Технологічний: дотримання всіх параметрів (тиск, температура тощо), що прописані в регламенті.

Хімічний – контроль складу готових поживних середовищ (а до цього контроль сировини на вміст речовин, джерелом яких ця сировина є), визначення накопичення ферменту в процесі ферментації.

Мікробіологічний контроль – передбачає контроль за ростом і розвитком продуценту, а також визначення наявності сторонньої мікрофлори на всіх стадіях від поживного середовища до закінчення ферментації.

Найбільш тривалим є культивування актиноміцетів і мікроміцетів. Закінчення глибинного культивування визначається за:

- накопиченням цільового продукту;

- зміною рН (як правило);

з-за закінченням регламентного часу.

Всі операції з ферментами повинні відбуватись на холоду.

Основні параметри культивування продуцентів ферментів поверхневим і глибинним способами наведено в таблиці 12.1.

 

Таблиця 12.1