БУЦЕНКО Л.М., Пенчук Ю.М., Пирог Т.П.

БУЦЕНКО Л.М., Пенчук Ю.М., Пирог Т.П.

ТЕХНОЛОГІЇ

МІКРОБНОГО СИНТЕЗУ

ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

Л.М. БУЦЕНКО, Ю.М. ПЕНЧУК, Т.П. ПИРОГ

ТЕХНОЛОГІЇ

МІКРОБНОГО СИНТЕЗУ

ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

Рекомендовано Міністерством освіти і науки України

як навчальний посібник для студентів вищих навчальних закладів

 

Київ НУХТ

УДК

 

Рекомендовано Міністерством освіти і науки України

(лист № від р.)

 

 

Рецензенти:

 

Григорюк І.П., член-кор. НАНУ, проф., д.б.н. (директор Навчально-наукового інституту охорони природи і біотехнологій Національного університету біоресурсів і природокористування України);

 

Патика В.П., акад. УААН, проф., д.б.н. (зав. відділу Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України);

 

Верьовка С.В., пров.н.с., д.б.н. (Провідний науковий співробітник відділу структури і функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України)

 

 

Л.М.БУЦЕНКО, Ю.М. ПЕНЧУК, Т.П. Пирог

Технології мікробного синтезу лікарських засобів. Навчальний посібник

 

В посібнику проаналізовано історію відкриття антибіотиків, наведено сучасні уявлення про типи взаємовідносин мікроорганізмів і біологічну роль антибіотиків, особливості біосинтезу антибіотиків різними групами продуцентів, біологічні основи ферментації для отримання антибіотиків і загальні принципи технології їх виробництва. Наведено дані щодо механізмів дії та практичного використання антибіотиків. Розглянуто питання стійкості до антибіотиків та шляхів її подолання. Розглянуто питання використання ферментних препаратів в медицині. Описано технологічні особливості культивування мікроорганізмів для отримання ферментів, методи виділення та очищення ферментних препаратів, технології виробництва протеолітичних, амілолітичних, ліполітичних та інших ферментних препаратів. Приділено увагу сучасним методам імобілізації ферментів та практичного використання імобілізованих ферментних препаратів.

Для студентів напряму 6.051401 «Біотехнологія».

 

 

Ó Л.М. Буценко, Ю.М.Пенчук,

Т.П.Пирог 2009

Ó НУХТ, 2009

ЗМІСТ

Зміст...............................................................................................................
Передмова…………………………………………………………………
Частина 1. ТЕХНОЛОГІЯ АНТИБІОТИКІВ…………………………...
1. ПОНЯТТЯ ПРО АНТИБІОТИКИ……………………………………..
1.1 Історія відкриття антибіотиків……………………………………….
1.2 Біологічне значення антибіотиків…………………………………….
1.3 Сфери застосування антибіотиків…………………………………….
1.4 Класифікація антибіотиків…………………………………………….
1.5 Резистентність мікроорганізмів до дії антибіотиків…………………
Питання для самоконтролю………………………………………………
2. ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ АНТИБІОТИКІВ……………………
2.1 Одиниці біологічної активності антибіотиків………………………..
2.2 Визначення антибіотичної активності мікроорганізмів……………
2.3 Визначення антивірусної дії антибіотиків……………………………
2.4 Визначення протипухлинної дії антибіотиків………………………..
2.5 Методи кількісного визначення антибіотиків………………………..
Питання для самоконтролю………………………………………………
3. МІКРООРГАНІЗМИ, ЯКІ УТВОРЮЮТЬ АНТИБІОТИКИ, ТА ПІДВИЩЕННЯ ЇХНЬОЇ ПРОДУКТИВНОСТІ………………………….
3.1 Пошук продуцентів антибіотиків……………………………………..
3.2 Підвищення антибіотичної продуктивності мікроорганізмів………
3.3 Зберігання штамів-продуцентів………………………………………
3.4 Система депонування штамів-продуцентів…………………………..
3.5 Вплив антибіотиків на штами-продуценти…………………………..
Питання для самоконтролю………………………………………………
4. КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ ДЛЯ ОТРИМАННЯ АНТИБІОТИКІВ…………………………………………………………...
4.1 Особливості біосинтезу антибіотиків у мікроорганізмів……………
4.2 Вплив умов середовища на антибіотичну продуктивність………..
4.3 Спеціальні умови культивування для отримання антибіотиків…….
4.4 Спрямований біосинтез антибіотиків………………………………...
Питання для самоконтролю………………………………………………
5. ПРОМИСЛОВЕ ОТРИМАННЯ АНТИБІОТИКІВ……………………
5.1 Загальні відомості про виробництво антибіотиків…………………..
5.2 Підготовка засівного матеріалу……………………………………….
5.3 Ферментація……………………………………………………………
5.4 Попереднє оброблення культуральної рідини, виділення і хімічна очистка антибіотиків………………………………………………………
5.5 Сушіння і фасування препаратів……………………………………...
5.6 Контроль готових препаратів антибіотиків………………………...
5.7 Лікарські форми з антибіотиками…………………………………….
5.8 Екологічні проблеми при виробництві та застосуванні антибіотиків………………………………………………………………...
Питання для самоконтролю………………………………………………
6. АНТИБІОТИКИ, ЩО УТВОРЮЮТЬ БАКТЕРІЇ…………………….
6.1 Граміцидин С…………………………………………………………...
6.2 Бацитрацини……………………………………………………………
6.3 Поліміксини…………………………………………………………….
6.4 Нізин…………………………………………………………………….
6.5 Батумін………………………………………………………………….
Питання для самоконтролю………………………………………………
7. АНТИБІОТИКИ, ЯКІ УТВОРЮЮТЬСЯ АКТИНОМІЦЕТАМИ…...
7.1 Стрептоміцин…………………………………………………………..
7.2 Тетрацикліни…………………………………………………………...
7.3 Авермектини……………………………………………………………
7.4 Ністатин………………………………………………………………...
7.5 Ріфампіцин……………………………………………………………
7.6 Дауноміцин……………………………………………………………..
7.7 Ландоміцин Е…………………………………………………………..
Питання для самоконтролю………………………………………………
8. АНТИБІОТИКИ, ЩО УТВОРЮЮТЬСЯ МІЦЕЛІАЛЬНИМИ ГРИБАМИ………………………………………………………………….
8.1 Пеніциліни……………………………………………………………..
8.2 Цефалоспорин………………………………………………………….
8.3 Напівсинтетичні цефалоспорини……………………………………
Питання для самоконтролю………………………………………………
9. АНТИБІОТИКИ не мікробіологічного походження та пробіотики……………………………………………………………...
9.1 Антибіотики з вищих рослин………………………………………….
9.2 Антибіотики тваринного походження………………………………..
9.3 Пробіотики……………………………………………………………..
Питання для самоконтролю………………………………………………
Частина 2. Технологія ферментних препаратів
10. ОСНОВНІ ПОНЯТТЯ ЕНЗИМОЛОГІЇ………………………………
10.1 Історія відкриття ферментів………………………………………….
10.2 Властивості ферментів як біологічних каталізаторів………………
10.3 Класифікація ферментів, найменування та номенклатура ферментних препаратів……………………………………………………
10.4 Одиниці активності ферментів. Визначення ферментативної активності…………………………………………………………………..
10.5 Джерела отримання ферментних препаратів……………………….
Питання для самоконтролю………………………………………………
11. ВИКОРИСТАННЯ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ………………...
11.1 Використання ферментів в різних галузях промисловості………...
11.2 Використання ферментних препаратів в медицині………………...
Питання для самоконтролю………………………………………………
12. ОСНОВНІ ТЕХНОЛОГІЧНІ ЕТАПИ ВИРОБНИЦТВА МІКРОБНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ…………………………..
12.1 Культивування мікроорганізмів для одержання ферментів……….
12.2 Екстрагування ферментів з поверхневих культур………………….
12.3 Осадження ферментів………………………………………………..
12.4 Очистка ферментів методом адсорбції………………………………...
12.5 Мембранні методи очищення ферментів…………………………..
12.6 Стабілізація та стандартизація ферментних препаратів…………...
Питання для самоконтролю………………………………………………
13. ОСОБЛИВОСТІ ОДЕРЖАННЯ ОКРЕМИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ………………………………………………………………
13.1 Амілази………………………………………………………………..
13.2 Протеази……………………………………………………………….
13.3 Ліпази………………………………………………………………….
13.4 Лактаза (b-галактозидаза)……………………………………………
13.5 Глюкооксидаза………………………………………………………..
13.6 Ферментні препарати тваринного походження…………………….
Питання для самоконтролю………………………………………………
14. ІМОБІЛІЗОВАНІ ФЕРМЕНТНІ ПРЕПАРАТИ……………………
14.1 Матеріали для імобілізації ферментів……………………………..
14.2 Методи імобілізації…………………………………………………
14.3 Застосування імобілізованих ферментів
14.4 Ферментні сенсори в медицині………………………………………
Питання для самоконтролю………………………………………………
Рекомендована література……………………………………..…………
Предметний показчик……………………………………………………..

ПЕРЕДМОВА

 

Біотехнологія в останні часи набула значення галузі знань, визначальної для сучасного науково-технічного прогресу загалом. Значна частина біотехнологічної промисловості у світі спрямована на виробництво фармацевтичних препаратів. Біотехнологічні медичні препарати за обсягами продаж складають більше 15% загального світового ринку фармацевтичних засобів. Щорічно на ринку з'являються нові препарати, при цьому більшість із них призначено для лікування хвороб, які раніше вважали невиліковними. Але не можна забувати, що, не зважаючи на новітні досягнення в галузі медицини і фармації, добре відомі хвороби, наприклад туберкульоз, грізно нагадують про себе у зв'язку з появою нових резистентних штамів збудників та послабленням профілактичних заходів. Тому розвиток фармацевтичної біотехнології пов'язаний не лише із створенням нових препаратів, а й з вдосконаленням технологій виготовлення та підвищенням ефективності відомих лікарських речовин і препаратів.

Найбільшим класом лікарських засобів, що одержують шляхом мікробного синтезу, є антибіотики. За різноманіттям і показаннями до застосування вони займають перше місце серед продукції світової фармацевтичної промисловості. Обсяг світового ринку антибіотиків збільшується в середньому на 10 - 12 % щорічно і становить більше 23 млрд. доларів. Виробництво антибіотиків виявилося надзвичайно наукоємною галуззю, яка потребувала нових знань від мікробіологів, біохіміків, генетиків і стимулювала розроблення сучасних біотехнологій, створення нового обладнання, врешті сам розвиток мікробіологічної промисловості.

Крім антибіотиків продуктами фармацевтичної біотехнології є вітаміни, ферменти, вакцини, гормони, а також нові гено-інженерні лікарські препарати, діагностикуми.

Серед лікарських засобів особливе місце належить ферментам. Ферментні препарати використовуються в багатьох галузях медицини. Так, протеолітичні ферменти використовують для лікування захворювань органів травлення. Їх же застосовують при лікуванні опікових уражень і різних ран для видалення некротичних тканин. У лікуванні патологій обміну речовин незамінні також ліпази. Протеїнази з фібрінолітичною дією використовують для розчинення тромбів. За допомогою таких препаратів, як стрептокіназа і урокіназа, лікують тромбоз коронарних судин серця, легенів, кінцівок. Ферментні препарати знайшли застосування також в системній терапії.

Використання ферментних препаратів в медицині не обмежується створенням лікарських препаратів. Ферменти необхідні для діагностики багатьох хвороб та вивчення функціонального стану організму. На основі ферментних препаратів розроблені спеціальні прилади – біосенсори, використання яких значно прискорює діагностику та робить її більш точною.

Необхідно зазначити, що найважливіший внесок мікробної біотехнології в медицину полягає в отриманні продукції, яку не можливо одержати шляхом хімічного синтезу. Зважаючи на це можемо стверджувати, що фармацевтична біотехнологія і в подальшому буде мати значення провідної галузі, розвиток якої стимулює новітні наукові дослідження і використовує їхні досягнення.

В Україні розвиток сучасних біотехнологій і використання їх у фармації досить обмежене, хоча традиційні біотехнології застосовують у виробництві лікарських препаратів вже більше 20 років. Нажаль із 62 препаратів мікробного походження, що належать до першочергових лікарських засобів, виробляють лише 10 – 12 найменувань. Структура фармацевтичного біотехнологічного ринку України відрізняється від структури світового ринку. Найбільшими сегментами ринку у нас є препарати пробіотиків, вакцини і сироватки, далі йдуть білки крові, антибіотики, ферменти і потім гено-інженерні препарати.

Головна мета даного посібника — ознайомлення читача з основними технологіями одержання антибіотиків та ферментних препаратів.

Перша частина посібника присвячена антибіотикам – найбільшому класу фармацевтичних сполук, які отримують мікробним синтезом. Велику увагу приділено проблемам класифікації антибіотиків, пошуку нових сполук та нових продуцентів, вдосконаленню технологій синтезу антибіотиків, проблемі резистентності до цих лікарських препаратів та шляхів її подолання. В посібнику відображено сучасні аспекти вивчення антибіотиків: створення високоефективних напівсинтетичних антибіотиків, одержання штамів-продуцентів гено-інженерними методами. Представлено також технології отримання найбільш важливих антибіотиків.

В другій частині посібника розглянуто питання біосинтезу, виділення та очищення ферментів, описано традиційні біотехнології виробництва окремих ферментних препаратів. Приділено увагу питанням використання ферментних препаратів у медичних цілях: розробленню лікарських препаратів на основі ферментів, а також використанню ферментів для створення діагностичних приладів.

В Україні навчальний посібник з технології мікробного синтезу лікарських засобів раніше не видавався.

Поняття про антибіотики

 

Антибіотики – це специфічні продукти життєдіяльності або їхні модифікації, що характеризуються високою фізіологічною активністю щодо певних груп мікроорганізмів (вірусів, бактерій, грибів, водоростей, протозоїв) або злоякісних пухлин, вибірково затримуючи їхній ріст або повністю пригнічуючи розвиток.

Характерними ознаками антибіотиків є:

· вибірковість дії. У цьому полягає їхня відмінність від загальнобіологічних ядів (спирт, перекис водню, перманганат калію, ціаніди, фенол та ін.). Кожен антибіотик є активним щодо певних груп організмів та не впливає на інші форми живих істот.

· висока біологічна активність щодо чутливих до них організмів. Тобто, антибіотики є активними за дуже низьких концентрацій. Так, концентрація пеніциліну, що спричиняє бактерицидну дію, становить 10^-6 г/мл.

Вибірковість дії антибіотиків забезпечується їхньою здатністю впливати на певні мішені в чутливих клітинах. По-перше, антибіотики можуть впливати на утворення структурних компонентів мікробної клітини, які відсутні у клітинах ссавців. Наприклад, більшість клітинних оболонок бактерій складається із пептидоглікану – макромолекули, що забезпечує еластичність оболонки бактеріальної клітини. Антибіотики пеніцилін та цефалоспорин пригнічують процес трансамінування на заключному етапі синтезу пептидоглікану. Наслідком цього є неможливість забезпечення міцності клітинної стінки бактерій і врешті їхня загибель. Клітини ссавців не потерпають, оскільки не містять пептидоглікану. По-друге, антибіотики можуть впливати на метаболічні процеси, властиві лише бактеріальним клітинам. Наприклад, сульфаніламіди інгібують ріст мікробних клітин шляхом блокування синтезу фолієвої кислоти. Фолієва кислота необхідна для підтримання життєдіяльності будь-якої клітини. Однак, якщо клітини ссавців отримують цей вітамін ззовні, то бактерії, що мають менш проникну мембрану, змушені синтезувати його самостійно. В утворенні фолієвої кислоти приймає участь пара-амінобензойна кислота (ПАБК). Молекули сульфаніламідів структурно схожі з ПАБК, завдяки чому конкурують з нею за зв’язування з ферментами і тим самим блокують синтез фолієвої кислоти, через це ріст бактерій припиняється. Антибіотик тетрациклін впливає на ріст бактеріальної клітини шляхом блокування синтезу білків. Як в клітинах бактерій, так і в клітинах ссавців синтез білків відбувається на рибосомах. Надходячи до бактеріальної клітини, молекули тетрацикліну блокують ділянки зв’язування транспортної РНК з рибосомами і зупиняють синтез білка. При надходженні до клітин ссавців тетрациклін діє так само, але його концентрація в клітинах ссавців завжди нижча ніж в клітинах бактерій, тому не відбувається впливового блокування. Дія антибіотиків типу ципрофлоксацину базується на пригніченні синтезу ДНК бактеріальної клітини. Цей процес відбувається майже однаково в бактеріальних клітинах та клітинах ссавців. Але фермент ДНК-гіраза має різні властивості, завдяки цьому ципрофлоксацин зв’язується лише з ДНК-гіразою мікробних клітин.

 

Класифікація антибіотиків

Класифікація антибіотиків за біологічним походженням.

1. Антибіотики, що утворюються мікроорганізмами, які належать до еубактерій:

а) ті, що утворюються представниками роду Pseudomonas – віскозин, піоцианін;

б) ті, що утворюються представниками родів Micrococcus, Streptococcus, Escherichia, Proteus, Lactococcus, Lactobacillus – низін, коліформін;

в) ті, що утворюються представниками роду Brevi і Bacillus – граміцидин, поліміксин, субтилін.

2. Антибіотики, які утворюються мікроорганізмами, що належать до порядку Actinomycetales:

а) ті, що утворюються представниками роду Streptomyces – стрептоміцин, тетрациклін, актиноміцин;

б) ті, що утворюються представниками роду Saccharopolyspora – еритроміцин;

в) ті, що утворюються представниками роду Nocardia – ріфампіцин;

г) ті, що утворюються представниками роду Actinomadura – карміноміцин;

д) ті, що утворюються представниками роду Micromonospora – гентаміцин, фортиміцин.

3. Антибіотики, які утворюються ціанобактеріями – малінголід.

4. Антибіотики, які утворюються недосконалими грибами (мікроміцетами): представники роду Penicilium – пеніцилін, гризеофульвін; Trichotecium roseum – трихотецин; Acremonium chrysogenum – цефалоспорин.

5. Антибіотики, які утворюються базидіо- та аскоміцетами – хетомін, термофіллін.

6. Антибіотики, які утворюються лишайниками, водоростями і нижчими рослинами: уснінова кислота (лишайник Usnea florida).

7. Антибіотики, які утворюються вищими рослинами – алліцин, госсипол, фазеолін.

8. Антибіотики тваринного походження – лізоцим, екмолін, інтерферон (за класифікацією Егоров, 2004).

Класифікація антибіотиків за спектром біологічної дії.

1. Протибактеріальні антибіотики вузького спектру дії, переважно активні до грампозитивних мікроорганізмів:

1.1. група пеніциліна і цефалоспорина.

1.1.1. біосинтетичні пеніциліни – бензилпеніцилін та його калієва, натрієва і новокаїнова солі;

1.1.2. напівсинтетичні пеніциліни – кислотостійкі, неактивні по відношенню до пеніциліназоутворюючих стафілококів – пропіцилін, оксицилін;

1.1.3. напівсинтетичні цефалоспорини – лінкоміцин, новобіоцин;

1.1.4. еритроміцин, олеандоміцин – макроліди.

2. Протибактеріальні антибіотики широкого спектру дії:

2.1. тетрацикліни біосинтетичні – хлортетрациклін, окситетрациклін, тетрациклін і похідні – диметилхлортетрациклін і диметилтетрациклін;

2.2. напівсинтетичні тетрацикліни – метациклін, доксициклін;

2.3. хлорамфенікол (левоміцетин);

2.4. аміноглікозиди – стрептоміцин, неоміцин, гентаміцин;

2.5. поліміксини;

2.6. граміцидини;

2.7. напівсинтетичні пеніциліни – ампіцилін, карбеніцилін.

3. Протитуберкульозні антибіотики – стрептоміцин, канаміцин, циклосерин.

4. Протигрибкові антибіотики – ністатин, гризеофульвін, трихотецин.

5. Протипухлинні антибіотики – для клінічного використання на сьогодні допущено лише декілька антибіотиків: з групи антрациклінів – доксорубіцин (адріанаміцин), акларубіцин і рубоміцин (даунорубіцин); з групи актиноміцинів – актиноміцини С і Д; з групи ауреолової кислоти – олівоміцин; з групи стрептонігрина – брунеоміцин.

6. Протиамебні антибіотики – фумагілін.

7. Противірусні препарати – до цієї групи передусім належать інтерферони. Вони є активними проти ДНК- та РНК- вмісних вірусів. Інших антибіотиків з широкою противірусною активністю поки що не знайдено. Однак синтезовано різні хімічні сполуки, що характеризуються противірусною активністю. Наприклад, амантадин і ремантадин пригнічують розмноження вірусу грипу; ацикловір і ганцикловір – вірусів герпесу; азидотімідин – вірусу СНІДу.

Класифікація за механізмом біологічної дії.

1. Антибіотики, які інгібують синтез клітинної стінки (пеніциліни, цефалоспорини, бацитрацини).

2. Антибіотики, що порушують функції мембран (валіміцин, граміцидин, ністатін).

3. Антибіотики, які вибірково пригнічують синтез і обмін нуклеїнових кислот.

3.1. Антибіотики, які пригнічують синтез РНК (актиноміцин, гризеофульвін, канаміцин).

3.2. Антибіотики, які пригнічують синтез ДНК (мітоміцини, саркоміцин, новобіоцин).

4. Антибіотики, що пригнічують синтез пуринів та піримідинів (азосерин).

5. Антибіотики, що пригнічують синтез білка (бацитрацини, тетрацикліни, хлорамфенікол, ерітроміцин).

6. Антибіотики, що інгібують процеси дихання (олігоміцини, уснінова кислота).

7. Антибіотики, що інгібують окислювальне фосфорилювання (валіноміцини, граміцидини).

8. Антибіотики, що мають антиметаболітні властивості (D-циклосерини, ацидоміцин).

9. Антибіотики – іммуномодулятори (циклоспорини, рубоміцин).

Класифікація антибіотиків за хімічною структурою.

1. Ациклічні

В залежності від будови в цю групу входять такі основні групи: жирні кислоти, ацетилени, полієни, сірко- та азотовмісні сполуки. Характерною особливістю полієнових антибіотиків є наявність системи, що містить від трьох до восьми спряжених подвійних зв’язків. Багато антибіотиків цієї групи містять аміносахар, окремі речовини в структурі мають іншу азотмісну структуру – ароматичні кетони.

2. Аліциклічні

Ця група антибіотиків включає похідні циклопентана (саркоміцин), циклогексана та циклогептана.

Саркоміцин

 

3. Тетрацикліни

Сполуки, близькі за своєю будовою, в основі яких є тетрациклін.

 

Тетрациклін

 

4. Хінони

Це бензохінони, нафтохінони, антрахінони.

 

Дауноміцин

 

5. Ароматичні

Похідні бензола, ароматичні небензольні сполуки.

Хлорамфенікол

Гризеофульвін

 

6. Кисеньвмісні гетероциклічні сполуки.

 

пеніцилова кислота

 

7. Олігоміцини

Сполуки, що мають дієнову систему.

8. Макроліди

Містять макроциклічне лактонне кільце, пов’язане з одним або декількома вуглеводними залишками – аміноcахарами.

9.Аміноглікозидні.

Стрептоміцин

 

10. Азотмісні гетероциклічні сполуки.

Містять складні кільчасті структури.

11. Поліпептиди.

Найбільш розповсюджені циклопептиди, що складаються з залишків L- та D-амінокислот.

12. Депсипептиди.

Складаються з залишків амінокислот, з’єднаних складноефірним зв’язком.

13. Актиноміцини.

Належать антибіотики, що мають феноксазинову хромофорну групу та різні депсипептидні ланцюги.

14. Стрептотрицини.

Відрізняються циклічною структурою та різним вмістом амінокислотних залишків.

15. Металвмісні сполуки.

Містять залізо та мідь.

Класифікація антибіотиків як лікарських препаратів.

Лікарські препарати з антибіотиками класифікуються відповідно системі ATC (Anatomical Therapeutic Chemical (АТС) classification system), яка прийнята ВОЗ в якості міжнародного стандарту методології для здійснення статистичних досліджень в галузі використанння лікарських засобів в різних країнах. Вона розроблена ВОЗ у 1969 р.

У системі АТС лікарські засоби, в тому числі антибіотики, класифікуються у відповідності до їхнього терапевтичного використання. Для кожної готової лікарської форми визначено лише один код АТС. Лікарський препарат може мати і більше ніж один код, якщо він містить різні дози активної речовини або представлений в декількох лікарських формах, показання до застосування яких різні.

За АТС всі лікарські препарати класифікують на групи, що мають 5 різноманітних рівней:

1) складається з 14 базових анатомічних груп, вони позначаються однією латинською літерою – від А до V, яка в коді стоїть першою. Наприклад, літерою „В” позначають препарати, засоби, що впливають на систему крові; літерою „V” – різноманітні алергени.

2) це групи, які розподіляються за основним терапевтичним застосуванням і позначається двома арабськими цифрами, починаючи з „01”. В коді знаходиться після латинської літери. Наприклад, В 03 – антианемічні засоби.

3) уточнення коду, ведеться латинською літерою. Наприклад, В 03 А – це препарати заліза.

4) ще більше уточнення, латинська літера. Наприклад, В 03 АА – це препарати двовалентного заліза.

5) це група за хімічною структурою, визначається двома цифрами. Наприклад, В 03 АА 07 – сульфат заліза.

6) Для кожної готової лікарської форми визначениц тільки один код АТС, наприклад, протигрибкові препарати місцевого застосування – D01AA, гризеофульвін (ЗАТ НВЦ “Борщагівський ХФЗ”) – Griseofubrum – D01AA08, поліміксин (ВАТ “Київ медпрепарат”) – D01AA09.

Лінімент синтоміцину – Chloramfenicol – D 06 AX 02,

Ампіцилін – Ampicillinum – J 01 CA 01

Ферментація

Ферментація відбувається при параметрах, що відображають фізіолого-біохімічні особливості біологічного агенту.

рН середовища.

Більшість бактеріальних продуцентів утворюють антибіотики при нейтральному значенні рН (рН 7,0), крім молочнокислих стрептококів продуцентів нізину, їх оптимальне значення рН 5,5 – 6,0.

Для культивування актиноміцетів оптимальне значення рН 6,7 – 7,8.

Для культивування мікроміцетів оптимальне значення рН 4,5 – 5,0.

Необхідно пам’ятати, що значення рН середовища не залишається постійним. Якщо в середовищі в якості єдиного джерела азоту використовують сірчанокислий амоній, то при використанні азоту середовище буде підкислятися (це не буде відбуватися за наявності значної кількості іонів калію). Якщо джерелом азоту є KNО₃, то під час культивування середовище буде підлужнюватися.

Сильна зміна рН середовища може призводити до зупинки росту продуценту і утворення ним антибіотика. Середовища необхідно складати таким чином, щоб впродовж ферментації рН залишався в межах допустимої для продуцента норми.

Температура.

Для більшості бактеріальних продуцентів оптимальною є температура 30 – 37^оС. Виключення – продуцент граміцидину, який культивують при 40^оС.

Актиноміцетні продуценти антибіотиків культивують при 26–30^оС.^.

Мікроміцетні продуценти антибіотиків культивують при температурі 25 – 28^оС.

Є поодинокі випадки використання термофільних продуцентів, які утворюють антибіотики при температурах 50–65^оС.

Аерація – суттєвий фактор при культивуванні продуцентів антибіотичних речовин, зважаючи на те, що більшість продуцентів – аероби. Ступінь аерації – один з засобів зміни окисно-відновних умов середовища (ступінь аерації – це співвідношення об’єму повітря до об’єму середовища в 1хв). Більшість антибіотиків утворюються при значенні ступеню аерації близькому до одиниці. Цей показник залежить від реологічних властивостей поживного середовища. Для аерації використовується стерильне стиснуте повітря.

В біосинтезі антибіотиків дуже важливим є явище піноутворення. Причини утворення піни: наявність у поживному середовищі досить великої кількості білків; високий ступінь аерації.

Утворення піни може стати причиною контамінації культуральної рідини. Крім того, цей фактор визначає коефіцієнт заповнення ферментера: чим піноутворення інтенсивніше, тим коефіцієнт заповнення нижчий.

Методи піногасіння:

1. Механічні: наявність піновідбійників в конструкції ферментерів, різка зміна тиску всередині ферментера.

2. Хімічні – використання піногасників. Піногасники – це природні (соняшника олія, тваринні жири) та штучні (ніоген, пропінол) поверхнево активні речовини. Кориснішими для біологічних агентів є натуральні піногасники, бо жири є джерелом вуглецю. Кількість піногасника повинна бути мінімальною, щоб не було зон із зниженим масообміном. Тому готуються емульсії піногасників у воді. Переваги використання емульсій піногасників: зменшення кількості піногасника при збереженні його активності, що є економічно доцільним, зменшення присутності сторонніх речовин в цільовому продукті, що полегшує стадії видалення та очистки антибіотика. Режим стерилізації піногасника жорсткіший, ніж режим стерилізації компонентів поживного середовища. Тому піногасник стерилізують окремо періодичним способом.

Контроль процесу ферментації:

1. Мікробіологічний – відсутність сторонньої мікрофлори, титр клітин продуценту, фізіологічний стан клітин.

2. Біохімічний – визначення динаміки споживання основних джерел вуглецю, азоту, накопичення цільового препарату.

3. Технологічний – визначення параметрів середовища – рН, температура, розчинний кисень.

Граміцидин С

На сьогодні відомо п’ять видів граміцидинів А, В, С_D, С(S) і D. Вони дещо відрізняються за амінокислотним складом. Найбільш активним є граміцидин С. Молекула цього антибіотика складається з 10 амінокислотних залишків 5 амінокислот: L-валін, L-орнітин, L-лейцин, D-пролін, D-фенілаланін.

 

L-Вал L-Орн L-Лей D-Фен L-Про

 

L-Про D-Фен L-Лей L-Орн L-Вал

 

Продуцент – Brevi bacillus (Bacillus brevis) subsp. G.B. Грампозитивні спороутворюючі паличкоподібні бактерії. Ізольовані із ґрунту. Продуцент, в процесі розвитку в рідкому поживному середовищі, дисоціює на ряд форм, які відрізняються морфологією колоній та іншими властивостями при висіві їх на тверді середовища з дріжджовим екстрактом. Ці форми – R (складчата), S (гладка), P⁺ та P^- (пласкі форми). S та P^- форми продуценту не здатні утворювати антибіотики.

Біосинтез граміцидину відбувається незалежно від процесу спороутворення. Антибіотик синтезується як в процесі спороутворення, так і клітинами, які активно розмножуються.

Умови отримання. Для отримання граміцидину С використовують м’ясні або дріжджові гідролізати. Температура культивування 40ºС максимальний синтез антибіотика відмічається у перші 24 год. Кількість антибіотику, яка утворюється, до 2500 мкг/мл. Важливе значення для отримання граміцидину має аерація: за низької аерації бактерії розвиваються погано і антибіотик майже не утворюється, а за дуже високої активно споживається субстрат, але антибіотик не утворюється. Необхідна інтенсивність аерації від 2,0 до 5,8 гО₂/(л*год).

Граміцидин С можна отримувати на досить простих синтетичних середовищах. Наприклад, середовищах наступного складу: янтарнокислий амоній 0,5%, гліцерин 1,5%, сульфат магнію 0,02%, двозаміщений фосфат калію 0,2%, дистильована вода, рН середовища – 7,0-7,3. На такому середовищі можна отримувати до 2000 мкг/мл граміцидину.

Біосинтез граміцидину відбувається за наявності двох ферментів – граміцидинсинтази І та ІІ в присутності АТФ і іонів магнію. Граміцидинсинтази знаходяться як в розчинній, так і в зв’язаній з мембранами формах. Синтез антибіотика відбувається не на рибосомах. Дослідники із США розробили метод ферментативного синтезу цього антибіотика.

Виділення граміцидину – культуральну рідину підкислюють соляною кислотою до рН 4,5-5,0 і видаляють осад, що містить дихлоргідрат граміцидина і бактеріальні клітини (рис 6.1). В подальших стадіях здійснюють екстрагування антибіотику з осаду за допомогою етилового спирту. Отриманий концентрат містить до 4% граміцидина і певну кількість інших сполук, які за необхідності, можуть бути видалені. Граміцидин С при упарюванні спиртового екстракту легко перетворюється в кристалічну форму у вигляді голок.

Рис. 6.1. Схема виділення граміцидину

Використання. Граміцидин С має досить широкий спектр антибіотичної активності стосовно грампозитивних і деяких грамнегативних бактерій. Використовують в хірургії при первинній обробці ран, лікуванні інфікованих ран та опіків.

 

Бацитрацини

Відомо до десяти індивідуальних речовин бацитрацинів. Не всі вони є безпосередньо продуктами життєдіяльності бактерій, а можуть утворюватися в процесі виділення та очистки цього антибіотика. Основною речовиною є бацитрацин А, який становить до 37% утворюваних бацитрацинів.

Бацитрацин А – складається з 10 амінокислот: т