Хроматографические методы анализа

В таких процессах разделения компонентов, как экстракция, в случаях, когда коэффициенты распределения между фазами для различных компонентов мало отличаются друг от друга, отделить их в одну ступень не удается. Чтобы повторить распределение много раз, прибегают к динамическим методам - ​​хроматогграфии. В хроматорграфическом процессе 2 фазы - неподвижная и подвижная (движущейся относительно первой). Поверхность распределения (предел) между этими фазами достаточно велика, что обеспечивает интенсивный перераспределение веществ, которые мы разделяем, между фазами. Продвигаясь, подвижная фаза многократно обменивается с неподвижной этими веществами, позволяя эффективно их разделять даже при близких коэффициентах распределения.

Хроматографию изобрел ботаник М.С.ЦВЕТ, что в 1901 опубликовал работу об отделении окрашенных компонентов хлорофилла. Хроматорграфические процессы широко применяют как в аналитической химии, так и в препаративном варианте - чтобы получить продукты отделения.

Методы хроматоґрафии классифицируют по различным признакам:

1) По физической природе неподвижной и подвижной фаз - на жидкостную (подвижная фаза является жидкой) и газовую хроматографию. В свою очередь жидкостную хроматографию разделяют в зависимости от состояния неподвижной фазы на твердо-жидкостную (неподвижная фаза твердая) и жидкостно-жидкостную (неподвижная фаза жидкая). Жидкостно-жидкостную хроматографию часто называют распределительной хроматографиею. Газовую хроматографию разделяют на газоадсорбционной (неподвижная фаза твердая) и газожидкостной или газораспределительную (неподвижная фаза жидкая).

2) По механизму сорбции - на молекулярную и хемосорбцийную. В молекулярной неподвижная фаза и компоненты, разделяющие, взаимодействуют силами Ван-дер-Ваальса. К хемосорбцийнои относят ионообменную, осадочную, лигандообменную, окислительно-восстановительную. Сорбция здесь вызывается соответствующими химическими реакциями.

3) По способу хроматоґрафування на фронтальную (рассматриваемая смесь непрерывно пропускают через неподвижную фазу, и компоненты начинают выходить из хроматографичной колонки в порядке увеличения их способности к сорб
ции) проявительную, или елюентную (где, введя порцию смеси, через неподвижную фазу в дальнейшем пропускают только подвижную, уже без анализируемых компонентов) вытеснительном (где, чтобы десорбировать компоненты, в дальнейшем пропускают подвижную фазу, к которой добавлен вытеснитель - вещество, способное сильно сорбироваться, высвобождая рассматриваемые компоненты).

4) По форме неподвижной фазы - на колонну (подвижную фазу помещают в колонку) и плоскостную (неподвижная фаза - полоса бумаги или тонкий слой сорбента, нанесенный на стеклянную или металлическую пластинку).

В современных приборах с колоночной елюентнои хроматоґрафии на выходе из колонки помещают детектор. Он дает сиґнал, зависит от концентрации компонентов, определяющих. На сиґнал должны влиять все компоненты. Селективность детектора относительно отдельных компонентов не имеет особого значения, поскольку селективность анализа обеспечивается разделением на колонке. Сигналы детекторов обеспечивают теплопроводность, электропроводность, поглощение излучений, теплота сгорания и т.д.

В идеале хотелось бы, чтобы в елюентний хроматографии отдельные компоненты выходили из колонки как очень узкие зоны. В действительности зоны размываются и компонент образует так называемый хроматографический пик - максимум концентрации (и соответствующего сигнала детектора), в окрестности которого сигнал постепенно спадает. Размывание в максимуме концентрации вызывается диффузией компонента как в направлении движения растворителя, так и в перпендикулярном направлении. Играет роль также и то, что равновесие процессов сорбции-десорбции устанавливается не мгновенно, а требует определенного времени. Способность колонки к образованию четкого максимума сигнала на ее выходе описывают в терминах модели теоретических тарелок. Эту величину используют, чтобы определить эффективность хроматографического процесса, чтобы сравнивать различные конструкции колонок, выбор подвижной и неподвижной фаз в прохождении (и размывании) зоны, соответствующие тому или иному реагентов.

Вводя величину «число теоретических тарелок», характеризующий качество разделения, размеры пике и т.д., использовали модель и терминологию процесса разделения, который был известен раньше хроматографию. Это процесс ректификации - тщательного разделения компонентов смеси летучих компонентов из-за их дистилляцию (перегона). Одноразовая дистилляция не дает желаемого разделения и нужны повторные процессы. Их можно организовать в ректификационной колонне, где испарения смеси компонентов, двигаясь вдоль колонны, многократно конденсируются и снова испаряются. Постепенно испарения все больше обогащаются более летучим компонентом (соответственно, конденсат - менее летучим), пока не достигнуто желаемого качества разделения. Некоторые конструкции колонн содержат так называемые «тарелки», в которых содержится конденсат, через который пропускают пары, чтобы достичь равновесия. Очередная порция испарений, обогащенная леткишим компонентом, поднимается с предыдущей тарелки, расположенной ниже, в следующую, верхнюю тарелку. Избыток конденсата, обогащенный менее летучим компонентом, сливается с верхней тарелки в нижнюю (а с первой тарелки - назад, в «перегонный куб»). В теоретической модели обе фазы в тарелке считают полностью перемешаны. Качество разделения определяется числом тарелок - чем их больше, тем больше число последовательных дистиляций имитирует колонна. Конечно, в хрома-тографическом оборудовании таких «физических» тарелок не увидишь, поэтому в теоретических моделях «тарелки» назвали «теоретическими».

Связывая число тарелок с формой хроматографии, используют модель размывания пика как случайного процесса, соответствует распределению Гаусса (или так называемом нормальном распределению). Мы должны с этим распределением еще встретиться, изучая рассеяние повторных измерений в задачах количественного анализа.

На рисунке изображен пик сигнала на выходе из колонки, форма которого - так называемая кривая Гаусса. На оси абсцисс может быть время, в которое регистрируют сигнал, или (если рассматривать пик, распределенный в колонке) расстояние от начала колонки в определенный момент времени. На оси ординат - концентрация компонента в подвижной фазе (или сиґнал детектора, h, пропорциональный концентрации. Как ординату относительную величину, h/h _max, где в знаменателе - максимальное значение сигнала. Уравнения Гауссовая пика -

h = h _max × exp {‑ [(t – t_R) / s ]² / 2} = [ А / (s )] × exp {‑ [(t – t_R) / s ]² / 2},

где t _R - время, соответствует максимум сигнала (величине h _max), а - общая площадь под графиком, s - параметр распределения, называется средним квадратическим отклонением. Эта функция симметрична относительно ординаты, соответствующей t _R. По свойствам распределения Гаусса, касаются функции проходят на расстоянии ± s от t _R, и пересекают ось абсцисс на расстоянии ±»s2 от tR. Определяя s по данным эксперимента, иногда измеряют ширину кривой (разность между значениями t) для двух симметричных точек с сиґналом h/h _max=0,5. Это расстояние равно» 2,345 s. По модели число теоретических тарелок равно

n = (t_R / s)²» 5,54 (t_R / w _1/2)²» 16 (t_R / w)²,

где w_1/2 - упомянутая выше ширина кривой для точек с h/h_max =0,5, w - расстояние между точками пересечения касательных с осью абсцисс, значение 5,54»(2,345) 2,16 = (2∙2)².

Различать зоны от двух компонентов А и В можно, если расстояние между ними больше ширины обеих зон. Чтобы количественно оценить способность различить эти зоны, вводят коэффициент разделения,

R _s = (t _{R B} – t _{R А}) / (s _A + s _B) = 1,18 (t _{R B} – t _{R А}) / (w _{1/2 A} + w _{1/2 B}),

где последний индекс в величинах указывает, к компонентам относится величина, а 1,18=2,345/2 - множитель, переводит w _1/2 в s. Здесь считается, что t _{R А}< t _RB (первым движется компонент А).

Тонкослойная хроматография (ТСХ). ТСХ предложена харьковскими учеными М. А. Измайловым и М. С. Шрайбер, что в 1938 опубликовали работу по разделению алкалоидов на пластинке с оксидом алюминия. В ТСХ неподвижную фазу наносят тонким слоем на стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинку. Близко от края пластинки, на так называемую стартовую линию, наносят небольшое количество пробы анализируемого раствора край пластинки погружают в растворитель, становится носителем для подвижной фазы. Действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что вызывает их разделения в пространстве.

Существуют варианты ТСХ, где подвижную фазу пропускают (через фитиль) от середины пластинки к ее краям, кольцами. Компоненты, разделяющие, движутся по радиусами.

Разработано также двумерную ТСХ, где, пропустив подвижную фазу в одном направлении, пластинку подсушивают и пропускают подвижную фазу иного склада в перпендикулярном направлении.

Основные характеристики ТСХ. На рисунке, представленном ниже, представлена ​​схема, указывающая расположение пятен от различных компонентов на ТСХ. Он соответствует процессу градуировки, когда капли образцов для двух растворов чистых компонентов были нанесены на стартовую линию a - a рядом друг от друга, но со смещением, чтобы они не смешивались, когда вещество переносит подвижная фаза. Фронт ее движения обозначено линией b-b. Фронт переместился от стартовой линии на расстояние xf, середина пятна от 1 го вещества - на расстояние x1, а середина пятна от 2 го вещества - на расстояние x 2. Двигаясь, пятна расплываются. Длину пятна от 1 го вещества на рисунке обозначены как l н-в, где индексы «н» и «в» соответствуют нижней и верхней границе пятна (так, расстояние, которое прошла нижнюю грань пятна от 1 го вещества на рисунке обозначены как xн).

Отношение расстояния от стартовой линии до середины пятна вещества, в пути, проходимого фронт подвижной фазы, это величина R _f, характерная для вещества и состава подвижной и неподвижной фазы. Для 1 й и 2 й веществ должны

R_{f 1} = x ₁ / x_f, R_{f 2} = x ₂ / x_f .

В теоретической модели процесса величины R _f являются постоянными, если постоянным остаются коэффициенты распределения, а следовательно и доля времени, проводит молекула вещества, абсорбируется (адсорбата) в подвижной фазе. Итак, следует измерить величины R _f для стандартных образцов веществ, и использовать их, расшифровывая хроматограмму для анализируемой смеси.

По значениям R _f идентифицируем вещества, осуществляя качественный анализ многих неогрґаничних и, особенно, органических аналитов.

Если аналит неокрашенный, то, высушив пластинку с хроматоґрамою, действующие на нее соответствующими реагентов, которые дают интенсивно окрашенные продукты с Аналит - проявляют хроматограмму.

ТСХ привлекает низкой трудоемкостью, простотой и доступностью оборудования, универсальностью в применении к различным сложных объектов. Осуществляя точные измерения, можно оценить эффективность процесса через число теоретических тарелок и величину R _s.

Сравнивая площади пятен (или их интенсивность) для объекта и стандартов, осуществляют и количественный анализ. С развитием компьютерной техники для количественного анализа в ТСХ разработано соответствующее проґрамне обеспечения. Хроматограмму сканируют, используя серийные цветные сканеры с их проґрамним обеспечением, дает 3 составляющих восприятия цвета (соответственно трехцветный зрения и связанных с ним конструкциям дисплеев, принтеров, вообще не только компьютерной, но и полиґрафичнои техники). Специальная компьютерная программе образования составной расшифровывает изображения от сканера, выводя из него 3 составляющие зависимости интенсивности цвета от расстояния между исследуемой точкой хроматограммы и стартовой линией. Эти функции можно выводить как наглядные графики (на экран или на принтер), интегрировать, сравнивать друг с другом (например, стандартного образца и объекта), перечислять в концентрации. Компьютерное оборудование достаточно распространенное, доступное и недорогое (по сравнению с оборудованием для хроматографического анализа другими методами). Поэтому указанное направление является перспективным.

Как и в других видах хроматографии, на эффективность разделения влияет прежде всего выбор неподвижной и подвижной фазы. Достаточно удобно использовать пластинки с неподвижной фазой, выпускает промышленность. У нас признание получили пластинки марки «Силуфол» на основе силикаґелю, выпускавшие в Чехословакии.

Наиболее широкий источник оптимизации конкретной методики - выбор состава растворителя в подвижной фазе. Чаще всего используют смеси органических растворителей. Более полярный компонент растворителя способствует большей сольватации полярных аналитов и уменьшению соответствующих R _f. Выбор растворителя осуществляем по сравнительным таблицам их свойств.

Условия ТСХ. Чтобы надеяться, что значение R _f в опытах постоянно, и эту величину можно использовать как надежную характеристику в анализе по ТСХ, следует поддерживать одинаковые условия как для стандартного вещества, так и для рассматриваемого объекта:

1) Образцы и объект готовят, используя одинаковый растворитель. Чтобы уменьшить расходы растворителя в течение движения фронта хроматограммы и (в типичном случае использования смеси растворителей) обеспечить постоянный состав растворителя, процесс осуществляют в специальной камере, атмосферу которой предварительно насыщают парами растворителя.

2) Концентрация анализируемых веществ и стандартов должны быть близкими, чтобы зависимости интенсивности пятна от концентрации были близки к линейным.

3) На пластинку наносят одинаковые объемы растворов объекта и стандартов. Площадь пятен на стартовой линии должна быть одинаковой. Растворы наносят микрокапли и дают растворитель испариться после нанесения каждой капли.

4) Растворы как объекта, так и стандартов готовят, используя тот же растворитель.

5) Уменьшая погрешности от колебания свойств неподвижной фазы, желательно растворы как объекта, так и стандартов наносить рядом.

 

Лабораторная работа № 6.1.